新型促血小板生成融合蛋白的基因工程制备及其作用机制研究

摘要

随着社会的发展,由多种原因引起的血小板减症越来越常见。血小板由骨髓中的巨核细胞产生,通过对巨核细胞增殖分化进行调控,可有效促进血小板生成。因此,具有升血小板作用的造血生长因子类基因工程产品倍受推崇。然而,目前临床上用于救治血小板减少症的该类药物种类稀少,且存在着可能产生中和性抗体、副反应突出、价格昂贵等多种缺点,临床上迫切需要能够高效升血小板的新型药物。
　　血小板生成素(thrombopoietin,TPO),又称巨核细胞生长发育因子(megakaryocytegrowthanddevelopmentfactor,MGDF),是调节巨核细胞生成和血小板产生最重要的细胞因子。通过与其受体(c-Mpl)结合,TPO能够激活巨核细胞中一系列的信号通路,发挥其促进巨核细胞增殖分化的功能。据此,人们尝试利用基因工程方法制备出重组人血小板生成素(recombinanthumanthrombopoietin,rhTPO)和聚乙二醇化重组人巨核细胞生长发育因子(pegylatedrecombinanthumanmegakaryocytegrowthanddevelopmentfactor,PEG-rhMGDF)两种第一代促血小板生长因子类药物。但是,PEG-rhMGDF在临床试验中产生了能够与内源性TPO交叉反应的中和性抗体,美国FDA因此全面禁止了重组人TPO类基因工程产品的临床实验。TPO模拟肽(thrombopoietinmimeticpeptide,TMP)是通过噬菌体表面展示技术鉴定出的一种由14个氨基酸组成,与c-Mpl具有高亲和力,但与TPO序列完全不同源的短肽。实验表明,TMP不仅能够在体外有效促进巨核细胞增殖,且在动物体内未发现其能够诱导产生中和性TPO抗体。然而,TMP分子量太小,难以通过基因工程方法制备,且在循环中极易降解,限制了其应用。
　　多项体内研究发现,人生长激素(humangrowthhormone,hGH)对造血干/巨核祖细胞增殖分化及促进血小板生成具有重要调控作用。hGH主要通过与其受体(growthhormonereceptor,GHR)结合发挥其生物学活性,该受体与c-Mpl同为I类细胞因子受体,能够激活相似的增殖分化信号通路。因此,我们设想将TMP与hGH进行融合,一方面利用与生长激素进行融合,提高分子量,使得TMP能够通过基因工程方法进行制备,同时延长其体内半衰期。另一方面,通过融合发挥TMP与hGH在促进巨核细胞生成及血小板产生方面的协同作用。
　　基于已有的研究基础,在国家“863”计划和新药创制科技重大专项课题的资助下,我们首先尝试通过巴斯德毕赤酵母表达系统对一个TMP分子与hGH的融合蛋白rTMP-GH进行了发酵表达及纯化制备。之后,为了提高融合蛋白的生物学活性,又设计了一种由两个串联的TMP分子(TMP二联体)与hGH组成的融合蛋白,并利用pMAL-p2x原核表达载体在大肠杆菌中进行可溶性表达与制备。在确认dTMP-GH具有显著促进巨核细胞生成活性的基础上,为了简化制备工艺、提高产量,进一步探索了在大肠杆菌中以温控诱导和包涵体表达方式生产制备dTMP-GH融合蛋白,通过工艺优化最终实现了该重组融合蛋白的高密度发酵表达及放大生产,获得了纯度大于98％,且具有高效促巨核细胞增殖分化活性的dTMP-GH融合蛋白基因工程产品。同时,从信号通路激活的角度对dTMP-GH融合蛋白促巨核细胞增殖分化的作用机制进行了探讨。所取得的主要研究结果与结论如下:
　　1.通过基因重组成功构建了pPIC9K-rTMP-GH真核重组表达质粒,筛选出高G418抗性的His+/Mut+多克隆表达菌株,实现了rTMP-GH在巴斯德比赤酵母GS115中的高密度发酵表达。经超滤、阴离子柱及分子筛纯化,获得了纯度大于95%的rTMP-GH重组融合蛋白。经体外实验证实rTMP-GH具有一定的促进巨核细胞增殖活性。
　　2.通过合理化设计酶切位点,成功构建了pMAL-dTMP-GH重组表达质粒。电转化大肠杆菌后,阳性克隆经IPTG诱导,获得可溶性融合蛋白MBP-dTMP-GH。通过亲和层析、Xa酶切、疏水株及分子筛再纯化,最终得到纯度达98.5%,且N端不含任何多余氨基酸的重组融合蛋白dTMP-GH。体外细胞实验证实,dTMP-GH能够以剂量依赖方式促进巨核祖细胞株M07e的增殖,其活性显著优于等摩尔剂量的rTMP-GH融合蛋白。
　　3.利用温控原核表达载体pBV220,通过包涵体形式实现了dTMP-GH融合蛋白在大肠杆菌中的高密度发酵表达,表达水平约为500mg/L。建立了包括包涵体变性、复性、阳离子柱层析、阴离子柱层析及分子筛层析的纯化方案,获得了纯度大于98%的dTMP-GH融合蛋白,得率为20%。其生物学活性与采用大肠杆菌分泌性表达方式制备的dTMP-GH无显著性差异。
　　4.体外实验证实,dTMP-GH促进早期巨核细胞增殖的活性较等摩尔剂量dTMP强,GH拮抗剂培维索孟预处理能够显著削弱dTMP-GH的促巨核细胞增殖活性,提示融合蛋白中的hGH具有增强dTMP促巨核细胞增殖分化的作用,而且这种增强作用可能通过巨核细胞表面的GHR介导发挥。
　　5.Westernblot分析结果表明,dTMP作用15min即可显著上调M07e细胞中STAT5和ERK1/2的磷酸化水平,1h左右磷酸化水平恢复正常,而rhGH却无明显促STAT5磷酸化作用,但在其作用1h后可出现ERK1/2的显著磷酸化,并可持续3h以上时间。提示rhGH可能通过缓慢而持续激活ERK1/2信号通路来增强dTMP诱导的巨核细胞增殖与分化。
　　6.激光共聚焦及Westernblot检测分析发现,rhGH处理能够显著上调成熟巨核细胞株Meg-01中肌动蛋白的表达,并能促进肌丝拉伸和细胞伪足伸出,提示rhGH具有促进巨核细胞分化成熟的作用。进一步研究发现,rhGH作用15min即可显著上调Meg-01中Akt的磷酸化水平,而dTMP对Akt无明显激活作用,提示rhGH可能通过激活Akt信号通路促进了巨核细胞的分化成熟。
　　7.dTMP-GH融合蛋白可同时发挥dTMP与rhGH的生物学活性。在M07e中,dTMP-GH作用可同时上调STAT5和ERK1/2的磷酸化水平,且ERK1/2磷酸化可持续3h以上。给予GH拮抗剂培维索孟能够抑制dTMP-GH对ERK1/2信号通路的持续激活作用。在Meg-01中,dTMP-GH作用可显著上调Akt的磷酸化水平,且该作用能够被培维索孟显著抑制。
　　8.对人脐血CD34+来源的原代巨核细胞的实验证明,dTMP-GH能够显著上调培养至7d原代巨核细胞STAT5和ERK1/2磷酸化水平,且ERK1/2磷酸化可持续至3h以上。并且dTMP-GH作用可显著激活培养至11d原代巨核细胞中的Akt信号通路。
　　总之,本研究通过探索不同的表达体系、优化表达条件和纯化工艺,从而成功实现了一种TMP二联体与hGH的重组融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达与制备,最终获得纯度大于98%的dTMP-GH融合蛋白。体外实验证实,dTMP-GH具有显著促进巨核细胞增殖分化活性,其中dTMP主要发挥促进巨核细胞早期增殖分化的作用,GH除了可以增强dTMP的促巨核细胞增殖活性外,还具有促进巨核细胞分化成熟的作用。因而,通过融合不仅间接增大了dTMP的分子量,使其可以通过基因工程方法进行制备,而且所形成融合蛋白还具有突出促巨核细胞增殖、分化和成熟的活性,显示出很好的开发应用前景。

目录

封面

目录

缩略语表

英文摘要

摘要

第一章 前 言

1.1 选题缘由

1.2 研究背景

1.3 研究意义

1.4 研究内容

1.5 研究方法

第二章 pPIC9K-rTMP-GH重组质粒构建及rTMP-GH融合蛋白在毕赤酵母中的表达、纯化与鉴定

2.1 材料与方法

2.2 结 果

2.3 讨 论

2.4 小 结

第三章 pMAL-dTMP-GH重组质粒构建及dTMP-GH融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达表达、纯化与鉴定

3.1 材料与方法

3.2 结 果

3.3 讨 论

3.4 小 结

第四章 pBV220-dTMP-GH重组质粒构建及dTMP-GH融合蛋白在大肠杆菌中的发酵表达、纯化与鉴定

4.1 材料与方法

4.2 结 果

4.3 讨 论

4.4 小 结

第五章 重组融合蛋白dTMP-GH促巨核细胞增殖分化机制研究

5.1 dTMP-hGH对巨核细胞生物学活性分析

5.2 dTMP-GH对巨核细胞增殖分化机制分析

5.3 讨 论

5.4 小 结

全文总结

参考文献

文献综述TPO模拟肽类血小板生长因子的研究进展

参考文献

攻读学位期间的研究成果

致谢