低氧对脂多糖诱导的牙周膜细胞炎症因子及OPG/RANKL表达的作用研究

摘要

牙周病是炎性骨吸收性疾病,其主要特征是牙龈、牙周韧带、牙骨质和牙槽骨因炎症破坏最终导致牙齿松动和脱落,是最常见的口腔疾病之一。高原环境十分复杂,而缺氧则是高原最主要的变化。流行病学调查研究显示:高海拔的高原环境下牙周炎的患病率显著高于平原地区。在前期动物实验研究中显示:在模拟高原低氧条件下,牙周炎病程发展快、炎症反应程度较重。牙周病原体及其代谢产物,特别是脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),它能激发免疫细胞和局部邻近组织细胞增加炎性因子的表达进而诱导宿主发生一系列免疫反应从而诱发牙周组织损伤。LPS对牙周膜细胞的影响的研究都已经较为广泛和深入, LPS可以刺激牙周膜细胞分泌多种炎症因子,如:IL-1,IL-6,IL-8,TNF-α,HSP60等等;同时,LPS可通过调节牙周膜细胞的OPG和RANKL的表达,从而影响牙周骨代谢。低氧也可以刺激牙周膜细胞产生TNF-α、IL-1β和IL-6、 IL-8等细胞因子。低氧亦可以通过调节OPG和RANKL的表达,刺激破骨,加重牙周炎。但低氧和LPS联合对牙周膜细胞的影响目前还未见相关报道。同时,蜕皮甾酮作为一种毒副作用很小的中药单体,先前研究显示其对许多组织缺氧具有保护作用,我们尝试探讨蜕皮甾酮作为高原牙周病治疗的可能性。为探讨高原牙周病的致病机制,本课题选用组织块结合酶消化法原代培养牙周膜细胞。在采用低氧及脂多糖联合刺激牙周膜细胞后检测TNF-α、IL-1β、IL-6、OPG及RANKL的表达。研究结果显示:低氧及脂多糖均可诱导牙周膜细胞炎症因子表达,低氧还可增强脂多糖诱导的炎症因子表达。同时添加NF-κB抑制剂 BAY11-7082能有效的抑制低氧增强的LPS诱导的炎症因子表达;蛋白免疫印记实验显示:低氧增强了LPS诱导的胞核内NF-κB及胞浆中I-κB蛋白表达,结果提示:NF-κB信号通路参与了低氧增强脂多糖诱导的炎症因子表达。低氧条件下LPS诱导的OPG/RANKL比率会进一步降低从而影响牙周病的进展。同时蜕皮甾酮能增强牙周膜干细胞的成骨分化作用。此研究对初步探讨高原牙周病的机制研究具有一定的意义,同时对高原牙周病的治疗也提供了新的思路。
　　主要研究内容和结果
　　研究目的
　　1.牙周膜细胞的培养及鉴定。
　　2.低氧增强细菌脂多糖诱导的牙周膜细胞炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α表达;
　　3.低氧增强细菌脂多糖诱导牙周膜细胞炎症因子表达的机制研究。
　　4.低氧及细菌脂多糖对牙周膜细胞RANKL、OPG的表达;
　　5.蜕皮甾酮对牙周膜干细胞增殖及成骨分化的作用。
　　研究结果
　　1.采用组织块法培养,能体外成功获取人原代牙周膜细胞。
　　2.低氧及脂多糖均可诱导牙周膜细胞炎症因子的蛋白表达,低氧可增强脂多糖诱导的牙周膜细胞炎症因子蛋白表达,并且呈现剂量依赖性及时间依赖性。
　　3.低氧及脂多糖均可诱导牙周膜细胞炎症因子的mRNA表达(P<0.05),低氧可增强脂多糖诱导的牙周膜细胞炎症因子mRNA表达(P<0.05)。
　　4.NF-κB抑制剂 BAY11-7082(20μM)能有效的抑制低氧增强的LPS诱导的牙周膜细胞炎症因子表达(P<0.05),然而JNK生化抑制子SP600125; ERK生化抑制子PD98059;P38生化抑制子SB203580及HIF-α生化抑制子YC-1(30μM)则对抑制低氧增强的LPS诱导的牙周膜细胞炎症因子表达作用不甚显著(P>0.05)。
　　5.低氧或LPS均能显著增强牙周膜细胞胞核内NF-κB及胞浆中I-κB蛋白表达水平。并且和LPS诱导的胞核内NF-κB及胞浆中I-κB蛋白相比,低氧和LPS诱导的牙周膜细胞胞核内NF-κB及胞浆中I-κB蛋白表达水平显著更高。
　　6.与对照组相比,LPS和低氧均可显著促进牙周膜细胞RANKL mRNA及蛋白表达(P<0.05),并且低氧可增强LPS诱导的RANKL mRNA及蛋白表达(P<0.05)。然而LPS和低氧诱导的OPG表达无明显变化(P>0.05)。
　　5.蜕皮甾酮通过诱导BMP-2表达促进牙周膜干细胞成骨分化。
　　研究结论:
　　1.低氧及脂多糖均可诱导牙周膜细胞炎症因子表达,并且低氧可增强脂多糖诱导的牙周膜细胞炎症因子表达。
　　2.低氧通过NF-κB信号通路增强脂多糖诱导的牙周膜细胞炎症因子表达。
　　3.低氧可以调节LPS诱导的牙周膜细胞OPG/RANKL比率从而影响牙周病的骨代谢。
　　4.蜕皮甾酮可能作为潜在的药物用于牙周炎的再生治疗。给高原牙周病的治疗提供了一定的思路。

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低氧对脂多糖诱导的牙周膜细胞炎症因子及OPG/RANKL表达的作用研究

第一章 前言

第二章 低氧增强脂多糖诱导的牙周膜细胞炎症因子表达

2.1 材料与方法

2.2结果

2.3 讨论

第三章 低氧增强脂多糖诱导的牙周膜细胞炎症因子表达的机制研究

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

第四章 低氧和LPS对牙周膜细胞RANKL/OPG系统的影响

4.1材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

第五章 蜕皮甾酮诱导牙周膜干细胞成骨细胞分化的研究

5.1 材料与方法

5.2 结果

5.3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述

攻读博士学位期间发表的文章

致谢