Cx43修饰的人脐血源基质细胞对人外周血淋巴细胞调节作用的体外研究

摘要

目的:
　　我们关于人脐血源基质细胞( human umbilical cord blood-derived cells, hUCBDSCs)的前期研究表明,hUCBDSC具有免疫调控作用,不仅在抑制异基因造血干细胞移植后移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)上发挥重要作用,亦能参与诱导免疫耐受[1][2][3]。但其具体机制及其在免疫系统中如何发挥调控作用有待进一步研究。连接蛋白(connexin,Cx)及其介导的缝隙连接细胞间通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)亦在骨髓基质调控淋巴细胞发育中发挥重要作用,如影响淋巴细胞的抗体分泌,细胞因子产生,白细胞的迁移等。Cx43广泛表达于骨髓、胸腺、脾脏以及其他淋巴组织,是参与造血调控的必要条件[4][5][6][7][8][9][10]。本室前期研究亦表明,骨髓基质细胞(human bone marrow stromal cells, BMSCs)主要表达Cx43,通过增强骨髓基质细胞 Cx43的表达能够对白血病细胞产生阻抑作用[11]。因此,我们在前期课题研究的基础上提出设想,增强hUCBDSCs的Cx43表达是否可以通过调节淋巴细胞功能而增强免疫调控功能呢?本实验通过观察转染 Ad-GFP或转染Ad-Cx43-GFP的 hUCBDSCs与外周血淋巴细胞共培养,观察其对人外周血淋巴细胞(lymphocyte)增殖、周期、凋亡,及其细胞因子分泌、CD4+CD25+T细胞比例的影响,从改善造血微环境GJIC功能角度这一新的角度探讨其对免疫细胞的调节作用。
　　研究内容和方法:
　　1.采集健康产妇足月妊娠顺产的脐带血,使用本室前期构建的稳定扩增体系培养hUCBDSCs。(6％明胶沉淀脐血红细胞,Percoll密度梯度离心分离,改良Dexter基质细胞培养体系)。采用 ficoll密度梯度离心法从粒细胞集落刺激因子( granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)动员后的外周血单个核细胞中分离出淋巴细胞,用倒置显微镜观察hUCBDSCs、淋巴细胞生长状况。
　　2. Ad-Cx43-GFP转染hUCBDSCs48小时后,免疫荧光、RT-PCR及Western Blot检测转染前后hUCBDSCs细胞Cx43蛋白及mRNA的表达情况,荧光淬灭法观察转染后GJIC功能改变。
　　3.体外将转染Ad-Cx43-GFP或未转染的hUCBDSCs与血细胞分离机采集的外周血单个核细胞并用 Ficoll密度梯度离心法分离出的淋巴细胞进行共培养,共培养48h后,采用CCK-8检测Cx43修饰的hUCBDSCs对淋巴细胞增殖作用的影响;采用流式细胞仪检测淋巴细胞周期、凋亡。
　　4.流式细胞术分选CD4+T、CD8+T细胞,将转染Ad-Cx4-GFP的hUCBDSCs分别与淋巴细胞及分选后的CD4+T、CD+8细胞共培养72小时后,收集共培养中上清液, ELISA法检测IL-4和IFN-γ分泌水平。
　　5.共培养72小时后,收集悬浮淋巴细胞,加入荧光抗体CD4-PE,CD25-Alex Flour647染色,流式检测CD4+CD25+Treg细胞比例。
　　研究结果:
　　1.体外成功培养 hUCBDSCs。普通倒置显微镜下观察原代培养的 hUCBDSCs呈多形性,有圆形,纺锤形甚至成不规则形。培养24天左右传代。传代后细胞形态较均一,多为纺锤形。
　　2.重组腺病毒载体 Ad-Cx43-GFP能够成功转染 hUCBDSCs,用滴度为100MOI的腺病毒载体转染 hUCBDSCs后24h即可见到免疫荧光,转染48h后的转染效率为85±3.2%(1ul/孔)。转染Ad-Cx43-GFP的Cx43mRNA及蛋白的表达较未转染组及转染Ad-GFP组明显增强;转染后的GJIC功能亦较未转染组或转染Ad-GFP组增强。
　　3.转染 CX43后的 hUCBDSCs呈现双向调控外周血淋巴细胞的增殖作用,其促进或抑制增殖作用与hUCBDSCs与淋巴细胞共培养比例有关。
　　4.当hUCBDSCs与淋巴细胞以1:8共培养时,在PHA刺激下能够促进S+G2/M期细胞比例,而当hUCBDSCs与淋巴细胞以1:4共培养时,能够促进淋巴细胞的凋亡。
　　5.共培养后,Cx43修饰的hUCBDSCs能增加淋巴细胞中CD4+CD25+T细胞比例。转染Cx43组HUCBDSCs分泌IL-4较转染Ad-GFP组增加,而IFN-γ分泌受到抑制。
　　结论:
　　1. Ad-Cx43-GFP能够成功转染 hUCBDSCs并增强 GJIC功能,成功构建了体外hUCBDSCs与淋巴细胞共培养体系;
　　2.转染Cx43后的 hUCBDSCs对淋巴细胞的增殖呈现双向调控作用,与hUCBSCs与淋巴细胞共培养比例有关;
　　3. Cx43转染的hUCBDSCs通过增加IL-4,抑制IFN-γ分泌,增加共培养中淋巴细胞CD4+CD25+T细胞数量参与免疫调控。

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缩略语表

英文摘要

中文摘要

第一章 前言

1.1 研究背景

1.2 研究意义

第二章 人脐血源基质细胞与G-CSF动员后外周血淋巴细胞的分离、采集与培养

2.1 材料与方法

2.2 实验结果

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 Ad-Cx43-GFP转染人脐源基质细胞及转染前后Cx43的表达和GJIC功能的检测

3.1 材料与方法

3.2 实验结果

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 CX43转染人脐血源基质细胞对外周血淋巴细胞的体外调节作用

4.1 材料与方法

4.2 实验结果

4.3 讨论

4.4 小结

全文结论

本研究的创新之处

参考文献

文献综述

攻读学位期间发表的论文

致谢