基于适配子功能化磁珠快速检测人巨细胞病毒PP65抗原的实验研究

摘要

背景:
　　人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)即人疱疹病毒5型,属疱疹病毒科乙组疱疹亚科。HCMV以人为唯一宿主,在人群中广泛传播,人群感染率在50％以上,但大多数感染者无临床症状,病毒长期潜伏于宿主细胞,呈隐性感染。HCMV易引起孕妇活动性感染从而造成胎儿先天感染,导致妊娠失败及新生儿发育迟缓等;在免疫系统发育不全及免疫功能受损或抑制等特定人群中,潜伏病毒被激活、增殖从而发生严重活动性感染,具有较高的发病率和死亡率。目前尚无有效的预防疫苗,感染治疗仅仅依靠有限的几种抗病毒药物,近年来,HCMV耐药病毒株的感染问题日益突出。因此,建立可靠的早期诊断方法是有效防治病毒感染的关键环节。
　　现有研究表明,HCMV的一些包壳蛋白在病毒的整个生命周期中发挥重要作用,包括病毒的侵入,基因表达,免疫逃逸,病毒的组装和排出,对其进行准确的检测可实现巨细胞病毒感染的早期检测和指导临床合理用药。其中,PP65蛋白是HCMV包壳蛋白和细胞外病毒颗粒的重要组成部分。目前,HCMV PP65抗原已作为HCMV活动性感染和新发感染的首选实验室诊断指标广泛应用于临床。临床上常用免疫荧光检测技术(Immunofluorescence assay,IFA)检测HCMV PP65抗原,该方法以血液白细胞为载体,对白细胞的数目和形态要求较高,仅适合血液样本,不适合骨髓干细胞移植、免疫抑制和免疫缺陷等粒细胞过少患者的血标本,以及脑脊液、尿液、羊水等其它体液样本,临床检测应用范围局限;其检测过程涉及白细胞的分离和多个抗体的孵育,操作繁琐,耗时长,成本高。
　　适配子(Aptamer)是利用SELEX技术从人工合成的大容量单链寡核苷酸文库中,经体外筛选获得的单链寡核苷酸。寡核苷酸适配子不仅可卷曲折叠形成特定的二级或三级空间结构,能高特异识别、高亲和结合靶分子,而且ssDNA适配子具有靶分子范围广,易于体外合成与修饰,性质稳定、易于保存,人工合成的适配子纯度高,批间差异小,成本低等特点。因此,适配子是一种能取代抗体的理想候选生物识别分子,已广泛用于疾病诊断、新药筛选、药物靶向运输等诸多领域。磁珠是一种微米级的磁性颗粒,具有超顺磁性、良好的生物相容性、较高的分散性和稳定性等特点,其表面可修饰不同的活性功能基团制备成功能化磁珠。适配子功能化磁珠综合了适配子靶向识别和结合能力与磁珠独特的理化特性,可用于复杂样品中微量靶分子的识别与富集,还可作为可溶性微量物质检测的固相载体,应用于微量物质的分离、生物测试分析、样品前处理、药物的磁控靶向输送等方面。
　　本研究针对HCMV PP65抗原临床检测面临的问题,将适配子与磁珠结合制备适配子功能化磁珠,建立一种适配子功能化磁珠夹心免疫荧光检测HCMV PP65抗原的新方法,实现尿液、血液等样本中游离HCMV PP65抗原的特异、灵敏、快速检测,拓宽HCMV PP65抗原检测的临床适用范围,对HCMV活动性感染的早期诊断具有重要临床应用价值。
　　目的:
　　以HCMV PP65抗原为靶分子,采用SELEX技术筛选其高亲和力、高特异性结合的寡核苷酸适配子,制备适配子功能化磁珠,构建一种适配子功能化磁珠夹心免疫荧光检测HCMV PP65抗原的新方法。
　　方法:
　　1.适配子的筛选:构建由两端固定序列和中间35个核苷酸随机序列组成的链长为78个核苷酸,库容量约为1015-1016的随机ssDNA文库,以HCMV PP65蛋白为靶标,采用SELEX技术进行8轮筛选,前3轮筛选以空白孔作为反向筛选,后5轮以重组HCMV PP65抗原所带GST标签蛋白作为反向筛选,去除非特异结合的ssDNA序列,确保获得高特异性的饱和ssDNA文库。
　　2.适配子的结构分析与活性鉴定:将筛选获得的ssDNA文库进行克隆、测序。利用DNAMAN软件分析预测适配子序列的二级结构,并采用酶联免疫法检测适配子与HCMV PP65蛋白结合的亲和性。
　　3.适配子功能化磁珠的制备与条件优化:选取亲和力最高的适配子进行修饰标记,经EDC共价偶联于磁珠表面,制备适配子功能化磁珠。并探讨适配子与磁珠的偶联比例、最适EDC浓度和最佳偶联时间,优化适配子功能化磁珠制备条件。
　　4.适配子功能化磁珠夹心免疫荧光检测方法的构建与检测条件优化:利用适配子功能化磁珠特异捕获与富集液相中的HCMV PP65抗原,以FITC标记的HCMV PP65单克隆抗体进行示踪,荧光显微镜观察检测结果,初步构建“适配子功能化磁珠-抗原-荧光单抗”夹心免疫荧光检测新方法。同时,观察适配子与PP65抗原、PP65抗原与荧光标记单抗的不同孵育时间对检测结果的影响,并建立适宜的检测条件。
　　5.临床标本检测及与PCR的方法学比较:收集40例临床疑似HCMV活动性感染患儿尿液样本,尿液上清和尿液沉渣裂解液中游离的PP65抗原分别用适配子功能化磁珠夹心免疫法进行检测,同时用荧光定量PCR法定量检测尿液沉渣中HCMV的DNA水平,比较两种方法的检测结果,验证新构建方法临床检测的准确性和可行性,并对本方法的最低检测限和检测重复性进行初步探讨。
　　结果:
　　1.以HCMV PP65抗原为靶蛋白,经过8轮SELEX筛选,获得了HCMV PP65蛋白的饱和文库,经克隆、测序,最终获得了6条与靶蛋白分子高特异性结合的适配子序列,分别命名为A4、A5、A6、A7、A10、A19。
　　2.适配子序列用DNAMAN软件进行二级结构的分析预测,结果显示,6条适配子的二级结构分别包含了数目不等的茎环样结构和大口袋茎环样结构,表明筛选获得的适配子均具有与PP65蛋白特异结合的空间结构基础。适配子的ELISA亲和性测定结果显示,适配子A4、A5、A6、A7、A10、A19与PP65抗原结合的吸光度(A)值在1.137-2.726之间,表明6条适配子与PP65抗原结合的亲和性均较高。其中适配子A4与PP65抗原结合的吸光度为2.726,提示适配子A4与PP65蛋白的亲和性最高,为最适目标适配子序列,可用于HCMV PP65抗原的特异、高亲和识别。
　　3.以适配子A4(GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGCATGGTCCTCGATCGT ATGGCTTTGCGGTCGTGTTCGACATGAGGCCCGGATC)作为HCMV PP65抗原的特异识别分子,标记修饰为5'-HEX-TTTTTGGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGCATG GTCCTCGATCGTATGGCTTTGCGGTCGTGTTCGACATGAGGCCCGGATCAAAAAA ANH2C7-3',通过EDC与磁珠表面的羧基偶联固定,荧光显微镜观察结果显示,适配子功能化磁珠表面可见清晰的红色荧光,表明适配子已成功修饰固定在磁珠表面,可用于PP65抗原的特异识别与富集。另外,制备适配子功能化磁珠时,实验发现0.5μL的羧基化修饰磁珠(25mg/mL),在0.5g/L的 EDC作用下,与2.5μL的适配子(1μmoL/L)偶联1h,其偶合效率最高。
　　4.以适配子功能化磁珠为捕获工具,通过“适配子功能化磁珠-抗原-荧光单抗”免疫夹心法,实现样品中游离HCMV PP65抗原的检测,其荧光显微镜观察结果显示,实验组部分磁珠表面带有特异的绿色荧光,且绿色荧光、红色荧光、磁珠三者之间具有良好的对应性,表明适配子功能化磁珠可以有效、特异捕获样本中的 PP65抗原,且与荧光单抗无非特异性结合反应,适配子与 PP65抗原具有良好的结合活性和结合特异性,可应用于 PP65抗原的检测。进一步优化检测实验条件,结果发现适配子功能化磁珠与待检样本孵育1h,即可实现对样本中PP65抗原的有效捕获与富集,而后与示踪的单克隆抗体孵育1.5h时,可实现对抗原的有效检测。
　　5.适配子功能化磁珠夹心免疫荧光法检测40例疑似HCMV活动性感染患儿尿液样本上清和沉渣裂解液中的PP65抗原,与尿液沉渣HCMV DNA的PCR定性结果进行比对,结果显示:尿液上清检测阳性符合率为75.9%,阴性符合率为100%;尿液沉渣检测阳性符合率为96.6%,阴性符合率为100%。结果提示适配子功能化磁珠夹心免疫法可用于尿液尤其是尿液沉渣HCMV PP65抗原的检测。
　　结论:
　　1.筛选获得了特异识别和高亲和结合HCMV PP65蛋白的适配子,可作为PP65抗原的特异识别分子,建立HCMV PP65抗原检测新方法。
　　2.优化了适配子与磁珠的偶合条件,成功制备了PP65蛋白特异适配子功能化磁珠,可作为尿液等复杂样本中游离HCMV PP65抗原的富集和检测载体。
　　3.建立的适配子功能化磁珠夹心免疫荧光检测方法应用于尿液HCMV PP65抗原的检测,检测结果与PCR结果符合率较高,检测特异性达到100%,是一种简便、快速、准确、成本低廉的HCMV PP65抗原检测新方法,有望应用于HCMV PP65抗原的快速检测。

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缩略语表

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第一章 前言

第二章 HCMV PP65抗原特异性适配子的筛选及活性鉴定

2.1 试剂与仪器

2.1.1 主要试剂

2.1.2 主要仪器仪器名称

2.2 实验方法

2.2.1 适配子的筛选

2.3 结果

2.3.1 HCMV PP65特异性适配子的筛选

2.3.2 适配子的二级结构预测结果

2.3.3 适配子的亲和性检测结果

2.4 讨论

第三章 适配子功能化磁珠检测HCMV PP65抗原

3.1 试剂与仪器

3.1.1 主要试剂试剂名称

3.1.2 主要仪器仪器名称

3.1.3 标本来源

3.2 实验方法

3.2.1 适配子功能化磁珠的制备

3.2.2 适配子功能化磁珠免疫荧光检测体系的构建

3.3 结果

3.3.1 适配子的标记修饰

3.3.2 适配子功能化磁珠的制备

3.3.3 磁珠-适配子最佳偶联条件的优化

3.4 讨论

全文结论

参考文献

文献综述

参考文献

攻读学位期间发表的论文

致谢