急性肺损伤微环境对大鼠原代Ⅰ型肺泡上皮细胞增殖、表型的影响

摘要

肺脏是体内最为重要的生命器官之一,由于其特殊的解剖结构以及与外界相通的性质,容易受到各种损伤,在创伤时,特别是严重创伤,常伴发急性肺损伤(Acute lung injury, ALI)。ALI,其病情严重阶段即ARDS。ALI后肺脏会启动修复过程,业已研究发现,多种类型的位于特殊微环境中的含量相对较少的细胞在损伤和修复过程中起到了非常重要的作用,包括外源性和内源性干/祖细胞。除干/祖细胞的可能性修复作用外,越来越多研究还显示,成熟的终末分化细胞在组织损伤后的修复中也可能发挥重要的作用。近年来,不少学者在多个器官组织内证实在一定条件下存在终末分化细胞的去分化现象。目前关于肺组织内是否也存在终末分化细胞的去分化现象,迄今尚未见文献报道。
　　Ⅰ型肺泡上皮细胞(Alveolar typeⅠ cell,ATⅠ),是一种大而扁平的细胞,它覆盖了95％以上的肺泡表面积,是多种类型损伤的靶细胞,如呼吸机所致的肺损伤。传统观念认为,ATⅠ是“终末分化的细胞”,只有被动的屏障功能,没有主动的功能特性,其损伤后由Ⅱ型肺泡上皮细胞(Alveolar typeⅡcell,ATⅡ)分化补充。但近年的研究发现,ATⅠ可能具有多样的生物学功能,除了参与气血屏障的形成外,还能够转运水和离子,同时还有一定的免疫调节功能。然而,在损伤情况下ATⅠ的生物学行为会发生哪些改变以及能否发生去分化,目前尚未见文献报道。
　　本研究在成功建立失血性休克复合内毒素损伤诱导的ALI动物模型和成功分离培养ATⅠ的基础上,利用ALI大鼠支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)和肺组织匀浆液(Lung tissue homogenates,LTH)模拟ALI微环境,在体外观察损伤微环境对终末分化的ATⅠ增殖能力的影响以及表型相关标志物表达的影响,初步探究急性肺损伤条件下ATⅠ可能的修复作用。
　　本研究主要发现如下:
　　1.利用“中性蛋白酶消化+IgG贴壁法+免疫磁珠法”成功分离、培养高纯度的大鼠ATⅠs,该方法稳定、高效;
　　2.培养所得细胞表达ATⅠs特异性标志物PDPN、AQP5、Cav-1,几乎不表达ATⅡ标志物pro-SPC,符合ATⅠ的特性;
　　3.急性肺损伤微环境均有一定的促进原代 ATⅠs增殖的作用,其中, ALI-D3-BALF,ALI-D3、D5-LTH能够在体外明显刺激ATⅠs增殖;
　　4.进一步用ALI-D3-LTH处理ATⅠs,通过检测肺泡细胞表型相关基因的表达情况,ATⅠ特异性标志物AQP5和RAGE基因表达有所降低,ATⅠ分化调控基因Klf2表达明显降低,发现SPC和Nkx2.1 mRNA的表达水平明显升高,通过免疫荧光和蛋白质印记的方法确认了pro-SPC蛋白的表达。其机制可能是肺损伤微环境诱导细胞去分化的结果。

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第一章 前言

第二章 大鼠Ⅰ型肺泡上皮细胞的分离、培养及生物学特性研究

2.1 材料和方法

2.1.1 技术路线

2.1.2 实验动物

2.1.3 主要仪器

2.1.4 主要试剂EDTA

2.1.5 主要液体配制(1) 75%酒精

2.1.6 实验方法

2.2 结果

2.2.1 ATⅠ的产量和活力

2.2.2 ATⅠ的纯度

2.2.3 ATⅠ的生物学特性

2.3 讨论

第三章 急性肺损伤微环境对大鼠原代Ⅰ型肺泡上皮细胞增殖、表型的影响

3.1 材料和方法

3.1.1 技术路线

3.1.2 动物模型实验动物

3.1.3 主要仪器

3.1.4 主要试剂O55：B5 LPS

3.1.5主要液体配制(略)[1]

3.1.6实验方法

3.2 结 果

3.2.1 急性肺损伤后局部伤情变化

3.2.2 BALF和LTH对原代ATⅠ增殖能力影响的初步分析

3.2.3 ALI肺组织匀浆(ALI-D3-LTH)处理对ATⅠ增殖能力影响的进一步确认

3.2.4 ALI肺组织匀浆处理对ATⅠ表型的影响

3.2.5 ALI-D3-LTH对ATⅠ发育重要基因Klf2、Snx5表达的影响

3.3 讨论

3.3.1 急性肺损伤与内源性修复

3.3.2 去分化现象与组织修复

3.3.3 肺组织与去分化现象

3.3.4 ATⅠ的发育生物学特点及其分化调控

3.3.5 急性肺损伤微环境对ATⅠ生物学特性的影响及其可能的意义

3.3.6 本实验的意义

全文结论

参考文献

文献综述

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢