二氢杨梅素通过PPARγ/FGF21/AMPK信号通路改善胰岛素抵抗的机制研究

摘要

糖尿病(diabetes mellitus，DM)已成为严重影响人类健康的全球性公共卫生问题之一。2型糖尿病(T2DM)是糖尿病最常见的类型，其主要特征是骨骼肌等外周胰岛素作用靶组织对胰岛素敏感性下降，即胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)。IR贯穿于T2DM发生、发展的全过程，同时也是导致糖尿病各种并发症的“动力”根源。临床常用的降糖药物如罗格列酮等噻唑烷二酮类(troglitazone，TZDs)等在改善IR的同时可促进脂肪储存、水钠潴留等，长期使用毒副作用明显，故临床使用受到极大限制。近年来，从天然植物化合物中筛选无毒副作用的新型降糖药物已成为胰岛素增敏剂类T2DM治疗药物的主要发展方向之一。
　　大量研究显示，膳食来源的植物化合物具有显著的健康保护效应，是药物研发很好的潜在供体。一些广泛存在于蔬菜水果中的黄酮类化合物如木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)等已被发现可降低血糖，增加胰岛素敏感性而调节糖代谢。二氢杨梅素(dihydromyricetin，DHM)，又名蛇葡萄素(ampelopsin，AMP)是药食两用植物藤茶（也称霉茶）中含量很高的一种黄酮类化合物，在嫩茎叶中含量高达20％以上（以干重计）。DHM分子结构与槲皮素、木犀草素极为相似，已被证实具有抗氧化、解酒保肝、抗肿瘤等多种药理功效。有动物实验报道，二氢杨梅素可降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠血糖，但其具体作用机制尚未明确。
　　过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor, PPARγ)是Ⅱ型核激素受体超家族成员之一，与机体糖脂代谢调节密切有关。临床常用的降糖药物罗格列酮等噻唑烷二酮类(TZDs)就是以PPARγ为作用靶标的胰岛素增敏剂，可有效改善IR。有研究表明在脂肪细胞中，PPARγ激动剂可诱导成纤维细胞生长因子-21（fibroblast growth factor，FGF21）的表达，从而进一步增加PPARγ的活性;而FGF21又可激活AMP依赖的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)，增强线粒体功能和氧化能力，从而改善糖耐量。本实验室另一课题组研究发现DHM可激活AMPK促进线粒体生成，进而改善大鼠在急性低氧条件下的体能下降。因此推测，藤茶提取物及DHM可能通过激活PPARγ、上调FGF21的表达，活化AMPK信号通路来实现改善胰岛素抵抗的作用。
　　本研究首先用高脂喂养SD大鼠并联合小剂量链脲佐菌素腹腔注射(STZ，30mg/kg)建立T2DM大鼠模型。建模成功后将T2DM大鼠随机分为糖尿病模型组(DIA)、二甲双胍组(MET,125 mg/kg)、二氢杨梅素组（DHM，100mg/kg）、藤茶提取物低剂量组（R50，50 mg/kg）、中剂量组(R100，100 mg/kg)及高剂量组（R200，200 mg/kg）6组。每组大鼠分别灌胃给药干预4周后，放射免疫分析法测定大鼠血清中胰岛素、胰岛素C肽;ELISA法测定大鼠血清FGF21水平;western blot法检测肌肉组织中IRS-1、Akt、FGF21、AMPK、PPARγ蛋白表达;qRT-PCR法检测肌肉组织中FGF21、PPARγ mRNA的表达，观察藤茶提取物改善胰岛素抵抗的效果;其次，以棕榈酸(Palmitic acid，PA)诱导L6骨骼肌成肌细胞建立胰岛素抵抗体外模型，进一步探讨DHM改善胰岛素抵抗的作用及其分子机制，为糖尿病的防治寻找新的策略，同时为新型降糖药物的研发提供实验基础。
　　主要结果与结论:
　　1.体内实验结果:藤茶提取物及二氢杨梅素可改善糖尿病大鼠的肌纤维萎缩、变性等炎性改变。与糖尿病组相比，二甲双胍组、二氢杨梅素组和藤茶提取物组大鼠血糖、血清胰岛素水平、HOMA-IR指数、血清FGF21水平显著降低(P＜0.05)，而胰岛素C肽水平显著升高(P＜0.05);肌肉组织中pIRS-1、pAkt、 pAMPK、FGF21、PPARγ蛋白表达上调，同时FGF21、PPARγ mRNA的表达升高(P＜0.05)，提示藤茶提取物及二氢杨梅素可显著改善STZ诱导的糖尿病大鼠的胰岛素抵抗。
　　2.体外实验结果
　　(1) DHM可剂量依赖和时间依赖增强PA诱导的胰岛素抵抗的L6细胞的葡萄糖摄取能力，并上调胰岛素信号通路相关蛋白pAkt、pIRS-1的表达，提示DHM可有效改善PA诱导的骨骼肌细胞胰岛素抵抗。
　　(2) DHM剂量依赖和时间依赖的激活AMPK，AMPK特异性抑制剂Compound C和AMPK siRNA明显抑制DHM介导的AMPK激活，并降低DHM介导的胰岛素抵抗的L6细胞葡萄糖摄取能力增强，并且pAkt、pIRS-1的表达水平升高，提示DHM改善L6骨骼肌细胞胰岛素抵抗作用可能与其激活AMPK有关。
　　(3) DHM剂量依赖和时间依赖的上调胰岛素抵抗的L6细胞FGF21的表达，FGF21siRNA显著抑制DHM对AMPK的激活作用，降低DHM介导的胰岛素抵抗的L6细胞葡萄糖摄取能力增强以及pIRS-1，pAkt的表达的上调，提示DHM通过上调FGF21的表达激活AMPK，进而发挥改善L6骨骼肌细胞胰岛素抵抗的作用。
　　(4) DHM剂量依赖和时间依赖的增加PPARγ的表达，而PPARγ特异性抑制剂GW6992和PPARγ siRNA能显著抑制DHM介导的FGF21表达上调和对AMPK的激活作用，抑制DHM诱导的pIRS-1、pAkt的表达的上调作用，进而降低DHM增强胰岛素抵抗的L6细胞葡萄糖摄取能力的作用，提示DHM通过激活PPARγ而上调FGF21的表达。
　　综述所述，二氢杨梅素具有改善胰岛素抵抗作用，该作用与其激活PPARγ、调控FGF21/AMPK信号通路有关。

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摘要

第一章 前言

第二章 藤茶提取物改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的作用

2．1 材料与方法

2．2 结果

第三章 二氢杨梅素改善L6骨骼肌成肌细胞胰岛素抵抗作用及机制研究

3．1 材料与方法

3．2 结果

全文讨论

全文结论

参考文献

文献综述 黄酮类化合物防治糖尿病的研究进展

攻读硕士学位期间发表的文章

致谢