Fgfr2S252W/+小鼠骨量、骨结构特性及BMSCs成骨分化调控机制的研究

摘要

目的:
　　Apert综合征(Apert syndrome，AS)是临床最严重的人类颅缝早闭。本研究将以Fgfr2S252W/+小鼠和BMSCs作为研究平台和实验切入点，通过比较野生型小鼠和Fgfr2S252W/+小鼠的长骨骨量、BMSCs的生物学特性、BMSCs成骨分化能力、BMSCs的基因差异表达，从整体动物水平、细胞及分子水平研究FGFR2S252W突变中BMSCs的生物学变化、FGFR2 S252W突变对BMSCs成骨分化的调控作用及其分子机制、FGFR2调控BMSCs成骨分化中与其它信号通路的协同作用。本研究不仅对于深入认识Apert综合征病理生理机制意义重大，而且能够揭示FGFR2参与调控BMSCs成骨分化的作用及机制，为骨再生和骨骼相关疾病治疗的新策略提供理论和实验依据。
　　方法:
　　为了获取Fgfr2S252W/+小鼠进行实验，我们首先对Fgfr2S252W/+小鼠进行保种、繁殖、基因型鉴定。Micro-CT扫描并分析来自2月龄和5月龄小鼠的股骨骨量。骨量的分析数据包括:骨小梁和骨皮质体积分数(Tb.BV/TV，Ct.BV/TV，％)，骨小梁数量(Tb.N)，骨小梁和骨皮质的厚度(Tb.Th，Ct.Th)，骨小梁分离(Tb.Sp)，骨小梁结构模型指数(Tb.SMI)，骨小梁和皮质骨矿物质密度(Tb.BMD，CT.BMD)。利用H&E染色和Von Kossa染色对脱钙骨和未脱钙骨进行组织学分析，以确定Fgfr2S252W/+小鼠中骨量的改变是否是由于骨骼的形成改变导致。OsteoMeasure系统分析胫骨的Tb.BV/TV和Tb.Sp。测定小鼠血清中总钙和磷酸盐水平，以确定在Fgfr2S252W/+小鼠中观察到的骨骼异常是否与系统性的矿物质平衡改变有关。PINP是一种敏感和特异性的成骨细胞活性标志物，所以我们用ELISA法检测血清中PINP的水平。
　　从6至8周龄同窝野生型和Fgfr2S252W/+小鼠股骨和胫骨获得BMSCs。利用流式细胞仪技术对野生型和Fgfr2S252W/+小鼠来源的BMSCs进行干细胞表面分子标志物的检测。为了比较野生型和Fgfr2S252W/+小鼠来源的BMSCs的功能，我们采用CCK-8法以及流式细胞仪检测BMSCs增殖、生长周期以及凋亡。为了进一步比较两种小鼠来源的BMSCs多向分化能力差异，对两种BMSCs进行了成骨和成脂的定向诱导分化实验，同时采用油红O染色和茜素红染色对脂滴和矿化结节进行检测，采用RT-PCR对成骨以及成脂的关键基因Oc、Runx2与PPARγ、LPL进行检测。
　　为了解FGFR2功能获得性突变对小鼠BMSCs成骨分化能力的影响，我们对W-BMSCs和M-BMSCs两组细胞进行成骨能力检测。首先将BMSCs成骨诱导4d、7d、14d后，检测成骨早期标志基因ALP的活性和染色。然后将BMSCs成骨诱导7d、14d和21 d后采用免疫荧光方法检测成骨的关键蛋白Op，Oc的表达情况，同时采用RT-PCR进一步确定细胞成骨基因Col-Ⅰ，Op，Oc，Runx2和OSX的表达水平。最后将细胞成骨诱导21d后，采用茜素红染色检测其矿化能力。
　　为研究FGFR2 S252W功能获得性突变影响下BMSCs成骨分化中与其它信号通路的协同作用，我们利用基因芯片技术比较分析W-BMSCs和M-BMSCs两组细胞基因差异表达，找到有意义的基因。利用基因芯片技术中聚类分析芯片数据分析发现，M-BMSCs中Wnt信号通路的抑制基因SFRP1、SFRP2和SFRP4表达上调。这种上调采用RT-PCR和Western Blot进行验证。SFRP1、SFRP2和SFRP4是Wnt/β-catenin信号通路的拮抗剂，我们猜测Wnt/β-catenin信号通路在FGFR2 S252W功能获得性突变下受到了抑制。为验证这一猜想，我们将W-BMSCs和M-BMSCs成骨诱导7d和21 d，分离提取胞浆、胞核蛋白，利用Western Blot检测Wnt/β-catenin信号通路的枢纽分子β-catenin的表达情况，RT-PCR检测Wnt/β-catenin信号通路关键靶向基因cyclinD1，lef1，and fzd4的表达水平。
　　如果Fgfr2S252W/+小鼠中BMSCs的生物学特性及成骨分化异常是由于Wnt/β-catenin信号通路被抑制造成，那么Wnt/β-catenin信号通路被激活可以减轻BMSCs的异常。Wnt3a可以上调Wnt/β-catenin信号通路，此部分实验我们将应用Wnt3a外源性重组蛋白调控Wnt信号通路。采用CCK-8分析加入Wnt3a后M-BMSCs细胞增殖能力，RT-PCR检测成骨基因Op，Oc，Runx2，OSX，Col-Ⅰ以及成脂基因PPARγ、LPL的变化趋势，ALP和茜素红染色观察改变Wnt信号通路活性后M-BMSCs成骨能力和矿化能力的变化。
　　结果:
　　1.小鼠股骨结构参数数据显示，2月龄Fgfr2S252W/+小鼠中Tb.N，Tb.Th，Ct.Th，Tb.BV/TV，Ct.BV/TV，Tb.BMD和Ct.BMD均低于野生型小鼠。
　　2.与W-BMSCs细胞相比，M-BMSCs的细胞形态无显著性差异，但细胞数量较少。
　　3.ALP染色和活性检测结果显示，成骨诱导4d、7d和14d时，M-BMSCs的ALP活性低于W-BMSCs，除14d外，其差异有显著性。免疫荧光结果显示在成骨诱导7d、14d和21 d后W-BMSCs、M-BMSCs两组细胞均表达成骨早期和晚期标志性蛋白Oc、Op。RT-PCR结果显示，FGFR2 S252W功能获得性突变作用下，BMSCs成骨诱导4d时Col-I、Op、Oc、Runx2、OSX的表达水平显著低于W-BMSCs。
　　4.利用基因芯片技术中聚类分析芯片数据分析发现，M-BMSCs中Wnt/β-catenin信号通路的抑制基因SFRP1、SFRP2和SFRP4表达上调。RT-PCR和Western Blot结果进一步证实了SFRP1、SFRP2和SFRP4的表达上调。
　　5.加入Wnt3a，上调Wnt/β-catenin信号通路后，M-BMSCs增殖能力增强。成脂诱导之后观察到M-BMSCs的成脂分化能力显著增强。
　　结论:
　　1、对2月龄和5月龄Fgfr2S252W/+小鼠长骨的骨量、骨结构特性及成骨细胞活性进行研究，发现随着年龄的增加，Fgfr2S252W/+小鼠的骨量没有丧失，反而增加，与野生型相比，2月龄Fgfr2S252W/+小鼠骨发育受到抑制而5月龄Fgfr2S252W/+小鼠骨发育反而高于野生型。其原因与全身机体的系统性矿物质平衡无关，可能是由成骨细胞的活性改变。
　　2、FGFR2 S252W功能获得性突变未改变小鼠BMSCs干细胞标记物特点，但影响了干细胞的数量、增殖能力、多向分化能力及凋亡。这为进一步探讨Fgfr2S252W/+小鼠BMSCs的功能提供了基础。
　　3、FGFR2 S252W功能获得性突变在成骨分化早期BMSCs的骨向分化潜能受到抑制，但在晚期却促进BMSCs的成骨矿化。这与小鼠体内观察到的与年龄相关的骨发育状况的改变情况一致。
　　4、FGFR2 S252W功能获得性突变抑制了BMSCs的Wnt/β-catenin经典信号通路。并且通过上调Wnt/β-catenin信号通路能够恢复或部分逆转BMSCs增殖、成脂分化及骨向分化功能的异常。提示:Wnt/β-catenin信号通路的抑制可能是FGFR2 S252W功能获得性突变的BMSCs成脂、成骨分化能力改变的主要原因之一。
　　总之，本研究确证了与年龄相关的Fgfr2S252W/+骨量和骨结构特性表型的改变，同时证实Wnt/β-catenin经典信号通路的失调是导致Fgfr2S252W/+小鼠BMSCs成骨分化异常的关键因素之一。本研究不仅有助于对于深入认识Apert综合征的病理生理机制，而且揭示了FGFR2参与调控BMSCs成骨分化的作用机制，能够为骨再生和相关骨骼疾病治疗新策略的提出，提供理论和实验依据。

目录

声明

英文缩略词表

摘要

第一章 前言

第二章 野生型小鼠和Fgfr2S252W/+小鼠长骨骨量及骨结构特性的比较研究

2．1 前言

2．2 实验材料与方法

2．3 结果

2．4 讨论

第三章 野生型小鼠和Fgfr2S252W/+小鼠BMSCs生物学特性的比较研究

3．1 前言

3．2 实验材料与方法

3．3 结果

3．4 讨论

第四章 FGFR2 S252W功能获得性突变对BMSCs成骨分化能力的影响

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．3 结果

4．4 讨论

第五章 FGFR2 S252W功能获得性突变影响下BMSCs成骨分化过程中与Wnt/β-catenin信号通路的协同作用

5．1 前言

5．2 实验材料与方法

5．3 结果

5．4 讨论

第六章 调控Wnt/p-catenin信号通路对Fgfr2S252W/+小鼠BMSCs生物学特性及成骨分化能力的影响

6．1 前言

6．2 实验材料与方法

6．3 结果

6．4 讨论

全文总结

参考文献

文献综述

博士在读期间发表文章

博士在读期间承担课题

致谢