激活TRPV1诱导自噬在血管平滑肌细胞泡沫化中作用及机制研究

摘要

背景和目的:
　　动脉粥样硬化形成以泡沫细胞在血管壁上沉积为特征性病理表现。泡沫细胞的增多促进了粥样斑块的发展和不稳定性，导致心脑血管事件的发生。动脉粥样硬化是心脑血管疾病的首要致病因素。泡沫细胞的主要来源是单核巨噬细胞和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)。早期动脉粥样硬化病变中的泡沫细胞主要来源于巨噬细胞，而中晚期病变中泡沫细胞主要来源于VSMC（45％为VSMC来源，只有30％呈现巨噬细胞标记）。相比于巨噬细胞性泡沫细胞形成的大量研究，来源于VSMC的泡沫细胞在近年才受到关注，其形成的具体调控机制还远未阐明。
　　泡沫细胞的形成是由于胞浆内出现大量含胆固醇酯核心的脂滴而使得细胞呈现类似泡沫样的外观改变。以往认为脂滴的代谢主要在胞浆内进行，由系列脂肪水解酶（如脂肪甘油三酯脂肪酶和单酰基甘油脂肪酶等）对其核心脂质进行分解。最近的研究证实，自噬介导的溶酶体内降解也是脂滴分解的重要途径。尤其是在动脉粥样硬化这个高脂环境中，自噬介导的脂滴分解可能较传统的胞浆分解途径起着更为重要的作用。更为直接的证据是在巨噬细胞源性泡沫细胞中，自噬通过溶酶体酸性脂肪酶调节胆固醇外流。抑制自噬会增加而诱导自噬会降低细胞内脂质的聚集。但是，目前少有研究报道自噬在VSMC泡沫样变过程中的作用。
　　瞬时受体电位香草醛亚家族1(transient receptor potential vanilloid subfamily1，TRPV1)可被辣椒素激活。TRPV1是非选择性阳离子通道并且对心脑血管疾病具有保护作用。以往研究显示TRPV1的激活可以通过减少脂质的摄取和增加脂质的转出而抑制VSMC泡沫样变。最近研究表明TRPV1的激活可以诱导肝细胞和胸腺细胞的自噬水平。此外，TRPV1的激活以后可以进一步促进腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activatedprotein kinase，AMPK)磷酸化，而后者在自噬的调控中发挥促进作用。我们设想，TRPV1的激活可以通过促进AMPK的磷酸化而诱导自噬，进而抑制VSMC的泡沫样变。
　　为了证实我们的假设，本研究分为三部分。第一部分探讨自噬在VSMC泡沫样变过程中的作用。利用氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，oxLDL)诱导原代VSMC泡沫样变。利用雷帕霉素(rapamycin，Rap)诱导自噬和3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）抑制自噬，探讨调控自噬对VSMC泡沫样变的作用。第二部分分题一在oxLDL诱导的VSMC泡沫样变模型中加入不同浓度的TRPV1激动剂辣椒素以及利用野生型和TRPV1敲除的VSMC，探索激活TRPV1对自噬的作用。分题二离体实验利用野生型和TRPV1敲除的VSMC，在体实验利用野生型和TRPV1敲除小鼠喂高脂以及辣椒素，探讨激活TRPV1对自噬溶酶体途径的作用。分题三利用小干扰RNA技术，敲低自噬关键基因Atg7，探讨自噬在TRPV1抑制VSMC泡沫样变中的作用。第三部分研究TRPV1激活诱导自噬的可能分子机制。利用野生型和TRPV1敲除的VSMC，oxLDL诱导泡沫样变，利用AMPK抑制剂compound C，探讨激活TRPV1是否通过活化AMPK通路而诱导自噬。
　　材料与方法:
　　离体实验主要利用C57BL/6J野生型和TRPV1-/-小鼠的主动脉原代培养的VSMC作为研究对象。在体实验分别利用C57BL/6J野生型和TRPV1-/-小鼠随机分为普高脂组（HFD组）和高脂加辣椒素组（HFD+Cap组）。
　　1.利用组织贴块法进行原代培养VSMC。
　　2.利用oxLDL刺激VSMC构建泡沫细胞模型。
　　3.采用蛋白免疫印迹的分子生物学技术，探讨自噬相关蛋白LC3、beclin-1及p62的变化以判断自噬水平。
　　4.采用油红O染色检测泡沫细胞形成，细胞内胆固醇检测分析细胞内胆固醇含量。
　　5.利用C57BL/6J野生型和TRPV1-/-小鼠的主动脉进行原代平滑肌细胞的培养，以TRPV1激动剂辣椒素及其特异性拮抗剂作为药物干预手段，采用蛋白免疫印迹法检测主动脉及平滑肌细胞上溶酶体相关蛋白LAMP1的变化，采用免疫荧光的方法检测LAMP1的表达。
　　6.利用转染siRNA技术，敲低自噬关键蛋白Atg7。
　　7.利用AMPK的抑制剂抑制AMPK的活性，检测Atg7及LC3的表达。
　　结果:
　　1.oxLDL呈浓度梯度地诱导VSMC脂质聚集，80μg/ml最明显;80μg/ml oxLDL呈时间依赖性地降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值、beclin-1的蛋白水平以及升高p62的蛋白水平，刺激24小时后变化最明显。
　　2.自噬诱导剂雷帕霉素可以减少油红O阳性细胞个数和细胞内总胆固醇的含量，而自噬抑制剂则增加油红O阳性细胞个数和细胞内胆固醇的含量。
　　3.TRPV1激动剂可呈浓度依赖性地逆转oxLDL降低的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和beclin-1的蛋白水平，该作用可被TRPV1拮抗剂或TRPV1-/-所抑制。
　　4.激活TRPV1可增加LAMP1的表达，TRPV1的特异性拮抗剂及TRPV1-/-则不能增加LAMP1的表达。
　　5.激活TRPV1可显著升高高脂喂养野生型小鼠主动脉LAMP1的表达，而对高脂喂养TRPV1-/-小鼠LAMP1的表达没有影响。
　　6.在con siRNA转染的VSMC，TRPV1激动剂可以升高LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值、beclin-1的蛋白水平以及减少油红O染色阳性细胞数和细胞内胆固醇含量，而对Atg7siRNA转染的VSMC，TRPV1激动剂则没有显示出上述效应。
　　7.激活TRPV1可增加p-AMPK的表达，TRPV1的特异性拮抗剂及TRPV1-/-则不能增加p-AMPK的表达;AMPK抑制剂compound C抑制p-AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值以及Atg7的蛋白表达。
　　结论:
　　本研究显示在oxLDL诱导的VSMC泡沫样变过程自噬水平是受到抑制的;调控自噬可以调节VSMC的泡沫样变;TRPV1的激活可以通过诱导AMPK磷酸化而逆转oxLDL抑制的自噬，从而抑制VSMC泡沫细胞形成。因此，本研究阐明了自噬在VSMC泡沫样变中的作用并突出了TRPV1作为动脉粥样硬化防治的潜在靶点。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 自噬在血管平滑肌细胞泡沫化过程中的作用

分题一 体外血管平滑肌细胞泡沫化模型的构建

2．1．1 材料与方法

2．1．2 结果

2．1．3 讨论

分题二 自噬在血管平滑肌细胞泡沫化过程的作用

2．2．1 材料与方法

2．2．2 结果

2．2．3 讨论

全章小结

第三章 自噬介导TRPV1调控血管平滑肌细胞泡沫化的作用

分题一 TRPVl激活对血管平滑肌细胞自噬的作用

3．1．1 材料与方法

3．1．2 结果

3．1．3 讨论

分题二 TRPV1激活对血管平滑肌细胞自噬溶酶体途径的作用

3．2．1 材料与方法

3．2．2 结果

3．2．3 讨论

分题三 自噬介导TRPV1调控血管平滑肌细胞泡沫化的作用

3．3．1 材料与方法

3．3．2 结果

3．3．3 讨论

全章小结

第四章 激活TRPV1诱导血管平滑肌细胞自噬的分子机制

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

全章小结

全文结论

参考文献

文献综述 血管平滑肌细胞自噬与血管疾病研究进展

攻读学位期间的研究成果

致谢