基于酵母微囊构建新型口服巨噬细胞靶向递送系统的研究

摘要

目的：
　　口服给药因其良好的安全性、便捷性与患者依从性是目前临床使用最为广泛的给药方式。近年来，随着纳米技术、材料学及药学等学科交叉研究的深入发展，现有的口服药物递送系统在肠道粘附释放、肠道局部靶向释放及肠道药物转运等方面已取得了诸多的进展，为大量难溶性药物提供了较为理想的口服载体系统。此外，有关新型靶向药物递送系统的大量研究已清楚地表明靶向释药在提高药物疗效的同时，可显著降低药物的非靶效应。与静脉系统靶向药物递送系统的高速发展相比，口服靶向药物递送系统的发展相对滞后。当前研究的口服靶向递送系统仍大多局限于以增加药物生物利用度为目的的消化道靶向（如肠道粘附系统、pH响应性结肠靶向递送系统等）或淋巴系统靶向。由于口服后吸收转运途径的复杂环境，迄今为止，针对胃肠道以外病灶部位的口服靶向药物递送系统仍鲜有文献报道。
　　为实现药物的口服靶向递送，本课题首次创新性基于仿生学原理，通过模仿微生物经消化道系统性感染途径，利用酵母微囊(Yeast shell，YS)表面的β-1，3-D-葡聚糖构建了新型口服巨噬细胞靶向递送系统，并基于炎症及肿瘤部位的巨噬细胞募集作用成功实现了炎症及肿瘤部位的口服靶向成像与药物的靶向递送。
　　方法：
　　1.酵母微囊的制备
　　2.正电荷纳米粒/酵母微囊系统的制备与表征
　　3.酵母微囊对巨噬细胞生物学活性的影响将小鼠源性巨噬细胞细胞株Raw264.7与酵母微囊按细胞与微囊个数比1∶50共孵育2h后，分别从巨噬细胞的吞噬与迁移两个方面研究酵母微囊对巨噬细胞生物学活性的影响。
　　4.口服酵母微囊的初步安全性评价
　　5.巨噬细胞对酵母微囊的识别作用研究
　　6.急性炎症靶向荧光成像的研究
　　7.荷瘤小鼠体内肿瘤靶向荧光成像研究
　　8.IONP YS在大鼠急性炎症模型中的磁共振成像应用
　　9.IONP YS在肿瘤磁共振成像中的应用
　　10.难溶性小分子药物-聚乙烯亚胺纳米组装体的制备与表征
　　11.纳米自组装体的体外抗肿瘤活性
　　12.载药酵母微囊的制备与表征
　　13.体外释放实验
　　14.体内药动学实验
　　15.体内药物分布实验
　　16.载药酵母微囊的体内抗炎疗效评价
　　17.酵母微囊的体内抗肿瘤活性评价
　　18.酵母微囊的肠道转运途径研究
　　结果：
　　1.基于酵母菌酸碱处理成功获得了外壁主要由β-1，3-D-葡聚糖构成的酵母微囊，其zeta电位为-6.5 mV左右，粒径约为4.5μm。并发现正电荷纳米粒可基于与酵母微囊之间的静电作用，首先富集于酵母微囊表面，随后进入酵母微囊内部形成QDYS、IONP YS等正电荷纳米粒/酵母微囊系统。
　　2.酵母微囊在5 g/Kg口服剂量下对小鼠并未表现出明显的毒副作用或造成明显的病理变化。
　　3.酵母微囊可基于Dectin-1受体被巨噬细胞快速识别并吞噬，其在巨噬细胞内具有较高的稳定性，可在巨噬细胞吞噬后7天保持较为完整的酵母微囊形态。
　　4.QD YS经口服给药后可靶向分布至足趾肿胀部位或裸鼠肿瘤部位，能够显著提高足趾肿胀及肿瘤部位的荧光强度，具有良好的口服炎症及肿瘤靶向性荧光成像效果。脏器及细胞水平的研究表明，QD YS在肝脾中具有较高的分布，其在肝、脾、足趾肿胀部位及肿瘤部位均特异性地分布于单核/巨噬细胞中。
　　5.IONP YS可口服靶向分布于足趾肿胀及肿瘤部位，YS负载提高了氧化铁纳米粒的T2弛豫作用，其效果与具有被动靶向效应的PEG-IONP无显著性差异。
　　6.基于含羧基疏水小分子药物与bPEI之间的多重非共价键作用力可成功制备粒径大小在几十纳米至几百纳米之间，具有高效载药性能与广泛药物适用性的正电荷纳米组装体。
　　7.正电荷纳米组装体表现出良好的体外生物学效应。PTX/IND/bPEI25正电荷纳米组装体可提高肿瘤细胞对PTX的摄取，显著增强其体外抗肿瘤活性，具有明显降低的IC50值，对于多药耐药细胞株有更为明显的优势。
　　8.通过酵母微囊与正电荷纳米组装体间的静电作用，可成功构建酵母微囊载药系统，如含IND的酵母微囊(IND YS)和含PTX的酵母微囊(PTX YS)等。该酵母微囊载药系统可被巨噬细胞快速吞噬。
　　9.体外药物释放研究表明酵母微囊载药系统可显著提高难溶性药物的体外释放速率;体内药动学评价证明酵母微囊载药系统能够明显增加IND的生物利用度，其药时曲线下面积(AUC)为IND原料药的4.5倍。
　　10.载药酵母微囊的体内组织与细胞水平的药物分布实验发现IND YS口服后可显著提高IND在机体单核/巨噬细胞中的分布，并依靠足趾肿胀部位巨噬细胞的募集作用，在该组织表现出靶向性的IND药物分布特征。
　　11.IND YS在角叉菜胶介导的急性足趾肿胀模型与弗氏佐剂介导的慢性关节炎模型中具有比对应IND/bPEI25纳米组装体更优异的抗炎能力，并能明显减轻IND对胃肠道的刺激。
　　12.基于B16F10荷瘤小鼠进行的口服抗肿瘤活性评价表明，PTX YS口服给药后有明显的肿瘤靶向效应，连续给药2周后其在肿瘤部位的PTX浓度可达到PTX注射液的7.8倍，并表现出优异的肿瘤抑制作用。
　　13.通过活体成像、体视荧光显微镜及CLSM进行的酵母微囊口服吸收途径的研究发现，QD YS主要粘附与吸收部位为回肠段的集合淋巴滤泡，进一步的免疫荧光染色表明QD YS在集合淋巴滤泡主要分布于M细胞与固有层的单核/巨噬细胞中。
　　14.脾切除可显著减少QD YS在足趾肿胀部位及单核/巨噬细胞中的分布。此外，健康小鼠在口服QD YS后，QD在脾脏巨噬细胞的分布与足趾肿胀小鼠相似，但在肝脏巨噬细胞、外周血单核细胞及足趾巨噬细胞中的分布却显著下降。
　　15.口服及静脉注射昆布多糖均可显著抑制QD YS在足趾肿胀部位及单核/巨噬细胞中的分布。口服昆布多糖可抑制肠道集合淋巴滤泡对QD YS的吸收。
　　结论：
　　1.成功制备了外壁主要由β-1，3-D-葡聚糖构成的酵母微囊，基于静电作用，可将表面正电荷纳米粒或纳米组装体高效负载于其中;通过Dectin-1受体，酵母微囊负载系统可被巨噬细胞特异性识别并吞噬。
　　2.酵母微囊经口服后可靶向递送至肿瘤及炎症部位的单核/巨噬细胞，通过炎症及肿瘤部位的单核/巨噬细胞募集作用，实现炎症与肿瘤部位的靶向成像，在细胞介导的靶向成像中具有良好的应用前景。
　　3.通过含羧基疏水小分子药物与聚乙烯亚胺之间的多重非共价键作用力可成功构建载有难溶性药物的正电荷纳米组装体;该类正电荷纳米组装体可自发沉积于酵母微囊内，获得具有较高载药性能的酵母微囊载药系统。
　　4.通过炎症及肿瘤部位的单核/巨噬细胞募集作用，酵母微囊载药系统可实现炎症与肿瘤部位的靶向药物递送，从而提高所负载药物的体内抗炎与抗肿瘤活性。
　　5.酵母微囊口服后吸收的主要途径为经肠道集合淋巴滤泡M细胞表面的Dectin-1受体识别进入肠壁固有层，被其中的单核/巨噬细胞摄取并迁移至肠系膜淋巴结内，随后分布至淋巴循环内，在最大的淋巴组织脾脏中广泛分布于其单核/巨噬细胞中，并通过脾脏在炎症状态下对炎症部位单核/巨噬细胞的补充与迁移，最终将酵母微囊转运至外周血、脏器及炎症部位单核/巨噬细胞中。
　　总之，本课题基于对微生物经胃肠道感染途径的认识，通过仿生学原理设计并构建了酵母微囊口服巨噬细胞靶向递送系统，并可基于炎症及肿瘤部位的巨噬细胞募集作用，实现炎症及肿瘤部位的靶向成像与药物的靶向递送。该载药系统制备方法简单高效，适用药物广泛，易于规模化制备，因此具有良好的应用前景。此外，该系统有望为口服炎症及肿瘤靶向药物递送的研究提供一种新的思路，并为其他巨噬细胞相关疾病的靶向治疗提供有效的递送策略。

目录

声明

英文缩写词表

摘要

第一章．前言

第二章．酵母微囊的制备、表征及其对正电荷纳米粒的负载性能研究

2．1 酵母微囊的制备与理化性能表征

2．1．1 材料与方法

2．1．2 结果

2．1．3 讨论

2．2 正电荷纳米粒／酵母微囊系统的制备及其负载机制研究

2．2．1 材料与方法

2．2．2 结果

2．2．3 讨论

2．3 正电荷纳米粒／酵母微囊系统的体外稳定性评价

2．3．1 材料与方法

2．3．2 结果

2．3．3 讨论

2．4 酵母微囊的初步安全性评价

2．4．1 材料与方法

2．4．2 结果

2．4．3 讨论

2．5 全章小结

第三章．正电荷纳米粒／酵母微囊系统在口服炎症及肿瘤靶向成像中的应用

3．1 酵母微囊-巨噬细胞的识别作用研究

3．1．1 材料与方法

3．1．2 结果

3．1．3 讨论

3．2 正电荷纳米粒／酵母微囊系统在炎症靶向性荧光成像中的应用

3．2．1 材料与方法

3．2．2 结果

3．2．3 讨论

3．3 正电荷纳米粒／酵母微囊系统在肿瘤靶向荧光成像中的应用

3．3．1 材料与方法

3．3．2 结果

3．3．3 讨论

3．4 正电荷纳米粒／酵母微囊系统在磁共振成像中的应用

3．4．1 材料与方法

3．4．2 结果

3．4．3 讨论

3．5 全章小结

第四章．口服巨噬细胞靶向性酵母微囊载药系统的构建与表征

4．1 基于含羧基疏水小分子药物的正电荷纳米组装体的制备及其表征

4．1．1 材料与方法

4．1．2 结果

4．1．3 讨论

4．2 无羧基难溶性小分子正电荷自组装体的制备及表征

4．2．2 结果

4．2．3 讨论

4．3 载药正电荷纳米组装体中药物与载体材料间的非共价键作用力的表征

4．3．1 材料与方法

4．3．2 结果

4．3．3 讨论

4．4 载药正电荷纳米组装体的体外生物学效应评价

4．4．1 材料与方法

4．4．2 结果

4．4．3 讨论

4．5 正电荷纳米组装体／酵母微囊载药系统的制备及其理化性能表征

4．5．1 材料与方法

4．5．2 结果

4．5．3 讨论

4．6 全章小结

第五章．酵母微囊载药系统在口服靶向治疗炎症与肿瘤中的应用研究

5．1 酵母微囊载药系统的体内外药动学研究

5．1．1 材料与方法

5．1．2 结果

5．1．3 讨论

5．2 酵母微囊载药系统的组织及细胞内药物分布评价

5．2．1 材料与方法

5．2．2 结果

5．2．3 讨论

5．3 酵母微囊载药系统在口服炎症靶向治疗中的应用

5．3．1 材料与方法

5．3．2 结果

5．3．3 讨论

5．4 酵母微囊载药系统在口服肿瘤靶向治疗中的应用

5．4．1 材料与方法

5．4．2 结果

5．4．3 讨论

5．5 全章小结

第六章．酵母微囊系统口服靶向机制的初步探索

6．1 酵母微囊系统口服肠道吸收途径的研究

6．1．1 材料与方法

6．1．2 结果

6．1．3 讨论

6．2 酵母微囊系统经肠道吸收后转运途径的研究

6．2．1 材料与方法

6．2．2 结果

6．2．3 讨论

6．3 酵母微囊系统口服靶向中Dectin-1受体的依赖性研究

6．3．1 材料与方法

6．3．2 结果

6．3．3 讨论

6．4 全章小结

第七章．全文结论

7．1 主要结论

7．2 特色与创新

7．3 问题与展望

参考文献

文献综述 M1／M2巨噬细胞极化分型的研究进展

攻读学位期间的研究成果

致谢