腺苷及其受体在心血管组织工程中的作用及机制研究

摘要

近几年，心血管疾病的发病率以及死亡率逐年升高，临床上对于直径小于6 mm的组织工程血管需求量很高。以腺苷及其受体为研究工具，从五个方面深入研究局部微环境的优化对组织工程血管长期通畅的影响。
　　一、腺苷通过调控细胞能量代谢优化组织工程血管微环境
　　证明了腺苷可以通过能量转换促进内皮祖细胞的动员和归巢，实现组织工程血管的早期快速内皮化。归巢的内皮祖细胞在腺苷的作用下，可以分泌VEGF、SDF-1和MMP-9等血管生成因子，进一步促进周围内皮细胞的增殖和迁移。此外，腺苷还可以通过细胞保护、调节炎症反应和抑制平滑肌增殖等机制优化组织工程血管移植后的局部微环境，最终促进血管移植物的长期通畅。为了解决腺苷在循环系统中半衰期极短的问题，我们制作了负载有腺苷的β-环糊精/壳聚糖纳米缓释颗粒，并通过层层组装的方式构建了腺苷修饰的组织工程血管。组织工程血管内表面涂层的腺苷分子能够快速的被释放，促进内皮祖细胞的动员和归巢，实现工程血管的快速内皮化，而负载有腺苷的β-环糊精/壳聚糖纳米缓释颗粒会缓慢地在局部释放腺苷，长时程优化移植的组织工程血管局部微环境，维持血管的持续通畅。
　　二、腺苷受体调控单核/巨噬细胞和内皮祖细胞之间的Crosstalk
　　腺苷发挥生物学功能主要通过两个途径:直接进入细胞作为ATP生成的底物参与细胞能量代谢;与细胞表面的腺苷受体相结合，激活其下游的信号通路。适度调控移植后的炎症反应可能会成为维持组织工程血管通畅的一个有效的途径。腺苷A2a受体在单核/巨噬细胞和内皮祖细胞表面均高表达，且具有促血管生成和炎症调控等功能，因此我们将腺苷A2a受体作为一个工具，研究腺苷受体激活对组织工程血管通畅的影响。我们首先制备了羟丙级-β-环糊精/壳聚糖纳米颗粒来控制腺苷A2a受体激动剂CGS21680释放和增加其水溶性，并采用层层组装的方式构建CGS21680修饰的组织工程血管，其可以控制药物在一个月内持续稳定释放。移植6个月后，CGS21680修饰的组织工程血管仍维持通畅，内皮化良好。我们进一步检测移植后不同时间段组织工程血管内单核/巨噬细胞核型的转换，结果发现移植后第3天相对于CGS21680组，对照组移植后M1型单核/巨噬细胞数量显著升高，并随着时间的累积进一步提升;而对照组M2型单核/巨噬细胞的数量要明显的低于CGS21680组。体外的结果显示内皮祖细胞在炎性刺激下显著表达E-selectin，促进单核/巨噬细胞核型向M1型的极化。腺苷A2a受体激活直接通过COX-2通路促进单核/巨噬细胞向M2型的极化和分泌更多的VEGF、IL-10等促血管生成因子，诱导内皮祖细胞迁移和动员;同时还可以通过降低内皮祖细胞表面促炎分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的表达，抑制单核/巨噬细胞向M1型的极化。综上，我们的研究第一次证明了归巢的内皮祖细胞在炎症刺激下，可以促进单核/巨噬细胞向M1型极化，加剧组织工程血管局部的炎症反应;腺苷A2a受体的激活可以通过调控内皮祖细胞和单核/巨噬细胞之间的Crosstalk，诱导移植产生的炎症反应向促进血管化的趋势发展，最终促进组织工程血管的通畅。
　　三、内源性腺苷维持组织工程血管长期通畅的作用研究
　　研究内源性腺苷对组织工程血管长期通畅的影响能为构建内源性腺苷持续稳定释放的组织工程血管提供理论基础。孔隙率和孔径大小与组织工程材料内的细胞的存活、增殖和分化紧密相关。大的孔径和相互连通的网络有利于材料内细胞与外界进行营养和氧气的交换，有文献报道维持材料内部血管与外界进行充足的氧气和物质交换的最小孔径大约为30到40 um。然而较大的孔隙率和孔径降低了生物材料的结构稳定性。组织工程血管移植后需要经受血液很大的流体剪切力和冲刷力，不稳定的材料结构容易引起组织工程血管堵塞、变形甚至破裂。有人认为组织工程血管内层的孔径应该小于24um，这低于维持物质交换所需的最小孔径。因此组织工程血管局部的微环境在外层毛细血管长入前是一个严重缺氧和营养匮乏的微环境，不利于浸润的单核/巨噬细胞的生存。磷酸盐浓度的升高与心血管疾病的发生紧密相关，此外磷酸盐浓度的升高还可以提高细胞的能量代谢，增加ATP的生成，这进一步加重了移植材料内部缺血缺氧环境下细胞的代谢负担，加剧了细胞的损伤和死亡。Klotho蛋白是一种抗细胞衰老蛋白，与钙磷代谢和能量代谢均紧密相关，这提示了Klotho蛋白可能具有促进内源性腺苷释放来发挥细胞保护的功能。我们的结果显示Klotho蛋白能改变生物材料内浸润的单核/巨噬细胞对胞外高磷的应答模式，降低能量代谢水平，维持细胞的存活和降低细胞凋亡。同时能量代谢的降低使细胞内ATP大量降解，释放大量的内源性腺苷。流式检测的结果显示外周血增多的腺苷可以打破骨髓中干细胞的静息状态，提高其能量代谢水平，促进更多的内皮祖细胞向外周血动员和向单核/巨噬细胞迁移。铁丝损伤实验结果表明Klotho蛋白可以促进血液中增多的内皮祖细胞归巢到损伤的部位，通过分化形成内皮细胞和旁分泌作用促进组织工程血管的快速内皮化。因此我们采用β-环糊精/壳聚糖纳米颗粒和层层组装的方式构建了Klotho蛋白修饰的组织工程血管，这种血管可以控制Klotho蛋白稳定释放超过一个月。移植六个月后，Klotho蛋白修饰的组织工程血管的通畅率达到了90％，远远的高于对照组。染色和扫描电镜的结果显示其内皮化程度良好，无明显的内膜增生和血栓形成。综上，我们的结果证明了Klotho蛋白具有将无机磷增加的信号通过调控能量代谢的方式最终转换为内源性腺苷的功能，内源性腺苷释放的增加可以通过促进内皮祖细胞动员和优化局部微环境维持组织工程血管的长期通畅。
　　四、腺苷在糖尿病疾病状态下保护内皮祖细胞的机制研究
　　研究糖尿病条件下微环境优化和干细胞保护对于构建抗高糖损伤的组织工程血管具有十分重要的意义。自噬是机体内一个重要的生理现象，可以将代谢废物转化为氨基酸等细胞进行三羧酸循环所必须的原料，加速细胞代谢废物清除。我们的研究发现在糖尿病患者体内，内皮祖细胞的自噬水平显著下降，而能量代谢的水平则显著升高，自噬与能量代谢稳态失衡最终引起内皮祖细胞促血管生成功能受损，甚至死亡。腺苷通过增加内皮祖细胞的自噬水平，维持自噬与能量代谢稳态的平衡，保护内皮祖细胞免受高糖的损伤和促进其向内皮细胞分化。为了在体验证腺苷对内皮祖细胞的保护作用，我们选择了糖尿病溃疡作为动物验证模型。内皮祖细胞在受腺苷刺激后种植到提前制备好的可降解生物材料上，培养48小时后移植到糖尿病溃疡的表面。结果发现腺苷显著增强内皮祖细胞-生物材料对糖尿病溃疡愈合的治疗作用，其机制是腺苷通过自噬保护移植内皮祖细胞促血管生成功能和促进其分化。综上我们的研究发现腺苷可以作为抗高糖损伤组织工程血管的一个构建靶点，来发挥细胞保护和促血管生成的功能。
　　五、抗高糖损伤组织工程血管的构建
　　腺苷具有内皮祖细胞动员归巢、干细胞保护和微环境优化等生物学功能，然而将其直接应用于糖尿病的血管替代治疗效果却很不理想，目前还未见可用于糖尿病血管替代的组织工程血管的成功报道。究其原因，主要是由于糖尿病外周血中的内皮祖细胞的迁移、旁分泌和分化等促血管生成的功能受到了严重的损害，归巢到组织工程血管内表面不能促进血管的快速内皮化;同时糖尿病体内高糖和氧化应激的微环境加剧了组织工程血管移植后的炎症反应，进而对归巢的干细胞造成了进一步的损伤。适合糖尿病的组织工程血管理想涂层药物至少需要同时具备干细胞捕获、恢复受损的干细胞功能、抵御高糖损伤和优化局部微环境四个功能。腺苷激酶(ADK)是一种催化腺苷生成ATP的核苷激酶，研究表明腺苷激酶表达上调会加速缺血条件下细胞的损伤和死亡，而腺苷激酶抑制有助于维持组织损伤状态下细胞能量代谢的维持，抵御疾病的损伤。同时腺苷激酶抑制的细胞可以持续的释放腺苷，腺苷是一种局部微环境的优化分子，具有调控炎症反应、细胞保护和促进血管生成等作用。这些都说明了腺苷激酶可以作为糖尿病状态下干细胞基因调控作用靶点的可能性。因此，我们构建了CD133/ADK嵌合体修饰的组织工程血管血管，其在糖尿病大鼠体内移植30天后依旧维持通畅，没有显著的内膜增生和血栓形成。我们的组织工程血管由组织工程血管支架和CD133/ADK嵌合体两个部分构成，移植前两个部分混合可以自组装形成稳定的RNA修饰的组织工程血管。我们准备了聚醚酰亚胺(PEI)/金纳米颗粒，颗粒大小约为200nm。制备过程中四氯合金酸(HAuCl4)的升高，降低了PEI/金纳米颗粒的转染能力，进而来减少RNA转染的非特异性;同时还增加组织工程血管的稳定性和生物相容性，更能抵抗循环系统的剪切和冲刷。CD133/ADK嵌合体由CD133适配体RNA和ADK SiRNA构成，CD133适配体特异性的捕获循环中的CD133阳性细胞。捕获的细胞能内吞结合的嵌合体，在细胞内Dicer酶的特异性剪切下形成ADK SiRNA，改善CD133阳性细胞受损的促血管生成功能，保护细胞免受高糖的损伤。同时转染的ADKSiRNA使得细胞成为了一个持续释放腺苷的生物反应器，腺苷具有显著的内皮祖细胞动员和微环境优化的作用。总之，我们成功构建了第一条RNA修饰的组织工程血管和第一条在糖尿病疾病状态下保持通畅的组织工程血管;CD133/ADK嵌合体通过特异性捕获、细胞保护和促进靶细胞持续释放腺苷促进组织工程血管在糖尿病状态下的快速内皮化和长期的通畅。我们的研究为疾病状态下组织工程血管的构建提供了新的思路。

目录

声明

英文缩写一览表

摘要

第一章 前言

第二章 腺苷通过调控细胞能量代谢优化组织工程血管微环境

2．1 材料与方法

2．2 实验结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 腺苷受体调控单核/巨噬细胞和内皮祖细胞之间的Crosstalk

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 内源性腺苷维持组织工程血管长期通畅的研究

4．1 材料与方法

4．2 实验结果

4．3 讨论

4．4 小结

第五章 腺苷在糖尿病疾病状态下保护内皮祖细胞

5．1 材料和方法

5．2 结果

5．3 讨论

5．4 小结

第六章 抗高糖损伤的组织工程血管构建

6．1 材料和方法

6．2 结果

6．3 讨论

6．4 小结

全文总结

参考文献

文献综述 内皮祖细胞捕获的组织工程血管研究进展

攻读博士学位期间发表论文情况

致谢