缺氧对LIMK1介导的cofilin磷酸化的影响及其在肠上皮屏障功能损害中的作用研究

摘要

目的：
　　肠上皮屏障功能损害及通透性增加是严重烧伤早期极其重要的病理生理变化，但其分子机制至今仍未完全清楚。既往的研究表明，肠上皮细胞间的紧密连接(tightjunction，TJ)通过其相关蛋白如ZO-1、Occludin、Claudin等与细胞骨架肌动蛋白(actin)相连形成信号互通，在维持肠上皮屏障功能完整性中发挥着重要作用。在相关信号刺激下，细胞骨架蛋白活动引起细胞回缩，紧密连接蛋白功能失调，细胞间TJ受损，细胞间隙形成，导致通透性增加。因此，肠上皮细胞TJ蛋白如ZO-1、Occludin、Claudin等与骨架肌动蛋白相互作用可能在烧伤后肠上皮屏障功能损害的发生中具有重要作用。
　　丝切蛋白(cofilin)是一种肌动蛋白结合蛋白，在肌动蛋白的聚合与解聚调控中具有关键作用。Cofilin活化能引起肌动蛋白解聚增加，从而调控F-肌动蛋白(F-actin)与G-肌动蛋白(G-actin)的动态平衡。同时，Cofilin活性又受到上游分子LIM激酶(LIMK)的调控，LIMK是一类具有丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸双重活性的激酶，能使其底物分子cofilin的Ser3位点发生磷酸化，从而调控cofilin活性。
　　因此，假设严重烧伤早期受氧自由基增加、ATP减少、细胞内Ca2+变化等诸多影响因素，有可能通过对LIMK的调控，引起肠上皮细胞cofilin活性变化，肌动蛋白动态平衡失调，影响TJ结构，导致肠上皮屏障功能损害及通透性增加。据此，本课题拟通过体外实验，建立肠上皮细胞单层模型，研究LIMK/cofilin/F-actin通路在缺氧条件下肠上皮屏障功能损害及通透性变化中的作用，以进一步阐明严重烧伤早期缺血缺氧时肠上皮屏障功能损害的分子机制。
　　方法：
　　1.培养人肠上皮细胞株Caco-2，将Caco-2细胞种植于Transwell建立肠上皮细胞单层模型。细胞分为正常对照组(缺氧0h)、缺氧1、2、6、12和24h组，细胞缺氧是在1％ O2条件下进行。
　　2.采用生物电阻测定仪检测跨上皮细胞电阻(TER)，以反映肠上皮细胞单层的屏障功能完整性;用异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(FITC-dextran)示踪法检测肠上皮细胞单层通透性的变化。
　　3.用间接免疫荧光法分别检测细胞TJ蛋白ZO-1、Occludin及claudin-1分布的变化，Western blot法分别检测细胞TJ蛋白ZO-1、Occludin及claudin-1蛋白表达的变化。
　　4.采用荧光法分别检测细胞F-actin的分布和F-actin/G-actin含量比值的变化。
　　5.采用Western blot法分别检测cofilin、p-cofilin、LIMK1及p-LIMK1蛋白表达的变化。
　　结果：
　　1.缺氧引起肠上皮细胞单层TER明显下降，通透性显著增加，以缺氧6h变化最明显。
　　2.缺氧对肠上皮细胞单层TJ蛋白Occludin及Claudin-1蛋白表达无明显影响，但引起ZO-1的蛋白表达降低，并引起ZO-1、Occludin及Claudin-1分布明显改变。
　　3.缺氧后肠上皮细胞单层F-actin形态分布明显改变，细胞回缩，F-actin/G-actin含量比值明显降低。
　　4.缺氧后肠上皮细胞单层cofilin蛋白表达无明显变化，但p-cofilin蛋白表达显著降低，cofilin磷酸化水平明显下降。
　　5.缺氧对肠上皮细胞单层LIMK1蛋白表达无明显影响，但引起p-LIMK1蛋白表达显著降低，LIMK1磷酸化水平明显下降。
　　结论：
　　缺氧能明显引起肠上皮细胞单层屏障功能损害及通透性增加，其分子机制可能是缺氧通过抑制肠上皮细胞LIMK1磷酸化而引起cofilin磷酸化水平降低及活性增加，导致细胞骨架F-actin解聚，破坏F-actin/G-actin动态平衡，从而改变TJ蛋白ZO-1、Occludin及Claudin-1的分布。

目录

声明

缩略语表

摘要

前言

1 材料和方法

1．1 实验试剂

1．2 实验仪器

1．3 实验方法

1．4 统计学分析

2 实验结果

2．1 缺氧对Caco-2细胞单层TER的影响

2．2 缺氧对Caco-2细胞单层通透性的影响

2．3 缺氧对Caco-2细胞单层紧密连接蛋白ZO-1、Occludin及claudin-1蛋白表达的影响

2．4 缺氧对Caco-2细胞单层紧密连接蛋白ZO-1、Occludin及Claudin-1的分布与形态的影响

2．5 缺氧对Caco-2细胞单层F-actin分布的影响

2．6 缺氧对Caco-2细胞单层F-actin/G-actin相对含量比值的影响

2．7 缺氧对Caco-2细胞单层磷酸化型cofilin及总cofilin蛋白表达的影响

2．8 缺氧对Caco-2细胞单层磷酸化型LIMK1及总LIMK1蛋白表达的影响

3 讨论

全文结论

参考文献

文献综述

攻读学位期间的研究成果

致谢