肝X受体β在小鼠炎性疼痛中的作用及机制研究

摘要

目的：
　　疼痛是由于伤害性刺激或组织损伤引起的不愉快的感官体验。肝X受体（LXRα和β）属于核受体超家族，它们是配体激活的转录因子。它们的配体是氧化胆固醇的代谢产物，它们参与调节脂质代谢基因。LXRs有2个亚型，LXRα主要表达在肝脏中，而LXRβ则全身多系统广泛表达，并在免疫系统和中枢神经系统(CNS)具有关键作用。LXRα敲除小鼠不会造成基本发育缺陷，而LXRβ缺失小鼠则会引起大脑皮层脑回受损，将会导致放射状胶质细胞(RGC)发育失常，最终引起胚胎发育期间新生神经元的迁移障碍。研究证实，LXRβ敲除(KO)小鼠大脑皮层放射状胶质细胞转化为少突胶质细胞或星形细胞会出现异常。LXRβ与多巴胺能神经元的发育密切相关，LXRβ的缺失增加肌萎缩性侧索硬化症-帕金森氏痴呆的风险。LXRβ特异性的在脊髓灰质的神经元和白质星形胶质细胞、少突胶质细胞的亚群表达。LXRβ缺失雄性小鼠成年后出现运动神经元变性。研究证实，LXRβ激活后，对脊髓损伤可产生神经保护作用。这些最新的研究表明，LXRβ为CNS的正常功能是必不可少的。目前的研究显示，LXRβ对疼痛调制的确切作用尚未阐明，LXRβ诱发的感觉过敏的分子机制是不确定的。对LXR调制痛觉过敏的细胞和分子机制的研究可为的临床治疗药物的开发提供新的策略。
　　方法：
　　1.观察LXRβ在与痛觉调制相关区域的表达，及其与疼痛在脊髓水平传导通路的关系。
　　2.观察LXRβ敲除小鼠和野生型小鼠痛行为行为学改变，明确LXRβ敲除小鼠痛行为的改变，及LXRβ对不同疼痛类型（热痛和机械痛）的影响。
　　3.建立福尔马林痛模型，观察LXRβ对炎性疼痛的调控，进行痛行为评分，评价量效关系，并观察福尔马林疼痛模型中，LXRβ敲除小鼠对比野生型小鼠表型改变对外周炎症的影响，以及评价分析炎性疼痛刺激情况下LXRβ对脊髓痛觉调制通路上脊髓背角神经元和胶质细胞激活的状态的影响。
　　4、Western blot定量分析对比6-7月龄野生型与LXRβ基因敲除小鼠脊髓pERK的水平，探讨LXRβ对炎性疼痛的调控的机制。
　　结果：
　　1.LXRβ在野生型小鼠的足底炎症组织及脊髓L3-L5节段均有表达。
　　2.哈格里夫斯实验中LXRβ敲除小鼠热缩足反射潜伏期（4.12±0.08秒）与野生型小鼠（6.26±0.13秒;p＜0.01）相比热缩足潜伏期显著缩短。在热板实验中，与野生型小鼠热板致痛潜伏期（7.52±0.28秒;p＜0.01）相比，LXRβ敲除小鼠（4.65±0.18秒）反应潜伏期显著下降。使用von Frey纤维丝测定机械痛阈值，LXRβ敲除小鼠和野生型小鼠在无害的机械刺激下，响应阈值没有差别。这些数据表明，LXRβ参与基础热痛阈调节，而对机械痛基础痛阈则无调节作用。
　　3.福尔马林足底注射后检测了LXRβ敲除小鼠和野生型小鼠足爪TNF-α，IL-1β、IL-6和NF-κB的水平，以及对注射足足爪肿胀程度进行检测评估。LXRβ缺失显著增加福尔马林诱导的足爪炎性因子TNF-α和IL-1β的水平，但是IL-6水平没有改变。LXRβ的缺失增加福尔马林诱导的足爪组织的NF-κB的表达。LXRβ缺失后出现以下福尔马林诱导的小鼠足底组织水肿程度与野生型小鼠相比，在第1小时和第2小时两个时间点均显著增加。这些结果表明，LXRβ缺失诱导的炎症疼痛超敏反应与NF-κB相关的促炎细胞因子的增加有关，且LXRβ缺失显著影响福尔马林诱导的外周组织炎症的程度。
　　4.两组小鼠右后足爪底射福尔马林后，小鼠产生的典型的双相疼痛反应。LXRβ敲除小鼠平均疼痛评分与野生型小鼠相比的各相伤害性反应显着增加。第一阶段:WT，2.37±0.25; LXRβ敲除，3.28±0.09，p＜0.01;第2阶段:WT，9.78±1.59; LXRβ敲除，13.95±2.51，p＜0.01）。分析了抬脚和舔舐时间，与野生型小鼠相比，LXRβ敲除小鼠显著增加。（第一阶段:WT，211.75±35.61秒;LXRβ敲除，372.75±20.41秒，p＜0.01;第2阶段:WT，571.5±60.61秒;LXRβ敲除，1194.6±161.89秒，p＜0.01）。这些数据表明，LXRβ缺失引起在福尔马林实验各个时相伤害性反应显著增强。
　　5.注射福尔马林到小鼠的后足爪后，诱导脊髓注射一侧Fos蛋白的大量表达。在野生型小鼠的脊髓L3-L5节段内，大部分的Fos标记的神经元在脊髓背角Ⅰ-Ⅱ层大量表达，而的Ⅲ-Ⅴ层Fos蛋白标记的神经元的数目比在Ⅰ-Ⅱ层显著降低。与野生型小鼠相比，LXRβ敲除小鼠注射福尔马林后，脊髓背角Ⅰ-Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ-Ⅴ层的Fos蛋白标记的神经元的数目分别增加43％，135％分别和85％。这一增长提示福尔马林注射后，足底注射诱导LXRβ敲除小鼠的脊髓背角更多伤害感受神经元激活。
　　6.c-Fos与CaBPs的免疫荧光双标染色结果中发现，LXRβ敲除小鼠与野生型小鼠相比，脊髓背角注射侧Fos+/Calbindin+和Fos+/Calretinin+双标阳性的神经元百分比显著增加。然而，脊髓背角Fos+/Parvalbumin+没有双标阳性的神经元。因此，研究结果表明LXRβ缺失引起小鼠足底注射福尔马林后2小时，诱导脊髓背角浅层兴奋性神经元的激活。
　　7.IB4与SP或CGRP的免疫荧光双标共定位结果发现，LXRβ敲除小鼠与野生型小鼠相比，小鼠接受注射福尔马林足底注射后，脊髓L3-L5腰椎节段注射侧背角浅层IB4，CGRP和SP的免疫阳性产物光密度值分别增加37％，47％，和47％。而脊髓L3-L5腰椎节段对照侧背角浅层IB4，CGRP，或SP免疫阳性产物光密度值没有显著差异。因此，LXRβ缺乏可促进福尔马林诱导的急性痛和炎症痛初级伤害性传入活化。
　　8.LXRβ敲除小鼠和野生型小鼠足底注射福尔马林2小时后，脊髓背角浅层pERK免疫学阳性细胞与NeuN标记的神经元进行共定位后发现，pERK+阳性细胞与NeuN+阳性细胞有共标，但不与GFAP标记的星形胶质细胞或Iba1标记的小胶质细胞有共标。同时Western blot检测了脊髓L3-L5节段pERK的水平，结果显示，LXRβ敲除小鼠脊髓pERK的水平较野生型小鼠显著增高。结果表明LXRβ的缺失可导致福尔马林诱导小鼠脊髓背角神经元pERK表达升高。
　　9.LXRβ敲除小鼠和野生型小鼠足底注射福尔马后2小时后，脊髓背角注射侧和对照侧均出现明显的星形胶质细胞活化状态。与野生型小鼠相比，LXRβ敲除小鼠注射福尔马林后2小时注射侧脊髓背角浅层Ⅰ-Ⅴ层GFAP阳性细胞的数量显著增加（野生型小鼠:131.4±9.83细胞个数/每张切片;LXRβ敲除小鼠，169.5±7.91细胞个数/每张切片;*p＜0.05）。LXRβ敲除小鼠对照侧脊髓背角GFAP阳性细胞的数目与野生型小鼠的相比，显著增高（野生型小鼠，106±1.5细胞个数/每张切片;LXRβ敲除小鼠，126.2±5.5细胞个数/每张切片;*p＜0.05）。
　　LXRβ敲除小鼠和野生型小鼠足底注射福尔马后2小时后，Iba1标记的免疫阳性细胞注射侧数量显著多于对照侧，且主要集中于背角浅层Ⅰ-Ⅱ层。与野生型小鼠相比，髓背角Iba1阳性细胞在同侧和对侧腰脊的数量在LXRβ敲除小鼠显著增加（注射侧，WT，111.8±3.5细胞个数/每张切片;LXRβ敲除，162.3±9.3细胞个数/每张切片;p＜0.01;对照侧，WT，84.1±4.0细胞个数/每张切片;LXRβ敲除，106.1±3.5细胞个数/每张切片;p＜0.01）。结果表明，福尔马林注射后，LXRβ缺乏激活小鼠的背角星形细胞和小胶质细胞，从而促进炎性疼痛的发生发展。
　　结论：
　　1.LXRβ在痛觉初级传入终端及脊髓均有表达并发挥重要作用。
　　2.LXRβ缺乏小鼠对有害热刺激和炎症性疼痛比野生型小鼠更敏感。
　　3.福尔马林实验中，LXRβ敲除小鼠在两个阶段均增强疼痛反应。这表明，LXRβ是外周和脊髓水平调制损伤诱导的痛觉过敏以及急性伤害性的关键因素之一。
　　4.LXRβ通过NF-κB途径调节促炎性趋化因子如TNF-α和IL-1β的合成或释放介导对福尔马林的炎症反应。
　　5.LXRβ调节小鼠脊髓背角浅层兴奋性神经元活性，抑制伤害性刺激引起的痛觉传入，进一步调节炎性疼痛。
　　6.LXRβ抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的活化，调节突触传递和神经元兴奋性，抑制中枢敏化和炎性疼痛发生和维持。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

1．1 选题缘由

1．2 研究背景

1．3 研究意义

1．4 研究内容

1．5 研究方法

第二章 LXRβ调控成年小鼠的基础痛阈的研究

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 LXRβ调控成年小鼠福尔马林诱发的外周炎症

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 LXRβ在脊髓水平调控成年小鼠福尔马林诱导的炎性疼痛

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．3 结果

4．4 讨论

4．5 小结

全文总结

参考文献

文献综述 脊髓小胶质细胞与神经病理性疼痛

攻读学位期间的研究成果

致谢