羟基磷灰石涂层硅橡胶生物安全性评价及细胞相容性提高的分子机制

摘要

背景与目的:
　　在人体组织器官缺损修复中，生物材料的应用越来越广泛。这类材料用于修复或替代病损组织器官并恢复其功能，且对人体无明显不良影响。生物相容性是材料在临床应用的重要制约因素，David Williams对人体植入材料的生物相容性定义如下：既能达到预期的既定目标，又不引起任何预期之外的局部或全身反应的性能。在整形外科领域，生物材料往往用做填充材料，主要分为天然来源生物材料和人工生物材料两种。人工生物材料又包括金属材料，无机非金属材料以及高分子材料。
　　羟基磷灰石是六方磷灰石系列的一种，它具有优良的生物相容性，无毒、无刺激性、无排斥反应、不老化、不致敏、不致癌。同时羟基磷灰石有很好的骨传导性，HA于骨之间结合牢固，与骨组织能达到较理想的生物结合。但是它脆性较高，难以雕刻成形。
　　本课题组结合两种材料的优点，避开两种材料的缺点扬长避短，前期成功制备羟基磷灰石涂层硅橡胶，并对其进行理化性能检测和初步的细胞相容性检测，发现羟基磷灰石涂层硅橡胶材料理化性能良好，并可以改善硅橡胶表面细胞相容性较差的缺陷。本课题将在前期研究的基础上对制备好的羟基磷灰石涂层硅橡胶材料的细胞相容性进行进一步的评价，并采用体内植入实验研究材料的生物相容性，同时对材料的生物安全性进行检测，进一步研究在材料一细胞界面中细胞和材料之间相容性的具体影响因素，探索在羟基磷灰石涂层硅橡胶表面细胞相容性较普通硅橡胶提高的可能分子机制。
　　方法:
　　本课题实验分四部分
　　第一部分:HA/SR的生物相容性检测和生物安全性评价
　　1、材料的生物相容性检测
　　将羟基磷灰石涂层硅橡胶以及普通硅橡胶表面培养的细胞通过细胞骨架染色，CCK8检测，扫描电镜观察以及材料表面细胞粘附相关分子包括vinculin、zyxin、talin等的分子检测进一步研究材料表面的细胞相容性，通过体内植入实验进一步研究材料的生物相容性。
　　2、材料的生物安全性评价
　　通过材料溶血率测定，试验动物体重、肝肾功能、脏器表面观察，植入实验及HE染色、Masson染色、免疫组化染色(CD4、CD68、TNF-a、a-SMA、elastin)，刺激实验，过敏试验和致热源实验研究材料毒理学性能和生物安全性。
　　第二部分:OPN在材料表面的吸附情况研究:
　　1、大鼠创面渗出液处理的材料表面蛋白吸附:
　　通过收集大鼠创面渗出液浸泡SR、HA-1/SR、HA-2/SR三种材料后进行材料表面普通光镜观察、扫描电镜观察，和测定材料表面水接触角分析大鼠创面渗出液浸泡处理后材料的性能变化，WB验证材料表面吸附的OPN蛋白情况。
　　2、材料表面粘附细胞OPN的表达和分泌情况
　　SR、HA-1/SR、HA-2/SR三种材料表面体外培养人真皮成纤维细胞，收集培养上清，提取细胞总蛋白，WB实验验证材料表面粘附细胞OPN的分泌以及表达情况。
　　第三部分:OPN在HA/SR表面细胞粘附中的重要桥梁作用研究
　　1、OPN对材料表面培养细胞粘附的影响
　　分别在SR、HA-1/SR、HA-2/SR三种材料表面培养人真皮成纤维细胞，同时分别在每组材料培养的细胞体系中加入外源性重组人OPN蛋白和OPN抗体，观察每组细胞的粘附情况。
　　2、OPN在细胞迁移中的作用
　　利用外源性OPN蛋白作为细胞趋化剂，采用Trans well细胞趋化实验验证OPN在细胞迁移中的作用。结合OPN对材料表面培养的细胞粘附情况共同揭示OPN蛋白在羟基磷灰石涂层硅橡胶材料表面的细胞粘附和迁移的重要作用。
　　第四部分:HA/SR细胞相容性提高的分子机制研究
　　1、通过RNA干扰技术降低MMP9的表达，了解OPN和MMP9的关系。采用质谱分析和生物信息学手段探索OPN和MMP9是通过哪种具体分子机制调控材料表面细胞骨架重排，介导羟基磷灰石涂层硅橡胶生物相容性的改变。
　　2、在SR、HA-1/SR、HA-2/SR三种材料表面体外培养人真皮成纤维细胞，提取细胞总蛋白，进行SDS-PAGE分离，经过凝胶成像系统采集图片，分析并切取差异点蛋白酶解后行质谱分析，在EMBL，NCBI等数据库分析质谱结果，分析可能的分子机制并采用WB回复验证。
　　结果:
　　1、HA/SR的生物相容检测
　　(1)将羟基磷灰石涂层硅橡胶以及普通硅橡胶表面培养的细胞通过细胞骨架染色，CCK8检测，扫描电镜观察，明确HA/SR表面具有较好的细胞相容性可以显著提高材料表面的细胞粘附和增殖。
　　(2)通过对材料表面细胞粘附相关分子包括vinculin、zyxin、talin等的分子检测进一步研究材料表面的细胞相容性，揭示羟基磷灰石涂层硅橡胶确实可以提高材料表面细胞粘附分子的表达，即提高SR表面的细胞粘附能力。
　　(3)通过将材料在大鼠体内植入7天，30天，90天，180天后取出，对材料周围组织HE染色发现组织生长状态良好，实验进一步证实了HA/SR材料的生物相容性。
　　2、HA/SR的毒理学性能检测及生物安全性评价
　　通过材料溶血率测定，试验动物体重、肝肾功能、脏器表面观察，植入实验及材料周围组织HE染色、Masson染色、免疫组化染色(CD4、CD68、TNF-a、a-SMA、elastin)，刺激实验，过敏试验和致热源实验研究材料毒理学性能和生物安全性，实验结果表明HA/SR安全无毒副作用，符合国家生物材料安全性的相关标准。
　　3、OPN蛋白在HA/SA表面的吸附情况
　　(1)通过对大鼠创面渗出液浸泡的材料表面外表观察、扫描电镜分析以及水接触角分析，我们发现大鼠创面渗出液浸泡的材料表面水接触角下降了，这可能与材料表面吸附有某种亲水性蛋白质有关。
　　(2)通过对HA/SR以及SR表面细胞的粘附蛋白质层进行WB验证，证明材料表面确实有OPN蛋白的吸附，同时，OPN蛋白在HA/SR表面的吸附量比SR表面吸附量更大，这可能与HA/SR较SR表面细胞相容性更佳有关。
　　(3)通过对材料表面粘附细胞外分泌的OPN蛋白以及细胞内的OPN蛋白进行半定量分析，证明在HA/SR表面粘附细胞分泌的OPN蛋白以及细胞内OPN蛋白的表达都较SR表面细胞高，进一步说明OPN在材料表面的吸附可能与HA/SR材料的细胞相容性提高有重要关系。
　　4、OPN在HA/SR表面细胞粘附中的桥梁蛋白作用
　　(1)通过外源性OPN的加入和OPN的抗体阻断实验可以看出:在HA/SR以及SR表面，外源性OPN的加入可以使得材料表面细胞的粘附增强，而当OPN抗体的加入使的材料表面OPN的结合减弱时，材料表面细胞粘附同时减弱，这一结果表明在HA/SR表面细胞相容性的提高和OPN存在着重要的正向相关性。
　　(2)通过Trans Well实验，OPN作为外源性蛋白加入细胞趋化小室外室可以显著提高成纤维细胞的穿膜能力揭示了OPN可能在材料/细胞界面提高细胞的迁移能力相关。通过对材料的表面蛋白质层的吸附分析以及采用外源性OPN蛋白的加入和OPN抗体的阻断，采用WB，Transwell等实验技术手段明确OPN在材料/细胞界面的重要作用，揭示OPN蛋白在羟基磷灰石涂层硅橡胶材料表面的细胞粘附和迁移中发挥着重要作用。
　　5、HA/SR细胞相容性提高的分子机制
　　(1)HA/SR材料表面MMP9的活性较SR表面显著增加，这表明随着羟基磷灰石在SR表面涂层，MMP9的活性增强了，这一点和HA/SR表面OPN的分泌趋势一致，这也表明MMP9可能和OPN存在某种正向相关性。
　　(2)MMP9干扰后材料表面细胞的粘附数量减少，细胞形态也呈现比较凌乱的状态，细胞骨架成皱缩，固着状态，但是这一形态的改变和粘附数量的减少可以为OPN所逆转，表明MMP9是OPN的下游分子参与细胞粘附，提高材料表面的相容性。
　　(3)通过质谱结果分析并通过NCBI数据库和EMBL数据库，找出主要差异点蛋白通过文献检索和分析我们提出可能是EF1β介导的γ-actin导致细胞骨架重排，从而影响材料表面细胞相容性，同时这一猜想被EF1β干扰致材料表面细胞粘附减弱这一实验现象所证实。
　　结论:
　　1、HA/SR具有良好的生物相容性。
　　2、HA/SR安全无毒，符合生物材料国家医疗器械生物学评价标准，具有良好的生物安全性。
　　3、提出并验证OPN在HA/SR表面的吸附对细胞的粘附和迁移有着重要的作用，是HA/SR表面细胞生物相容性提高过程中的桥梁蛋白。
　　4、提出并初步验证OPN可能通过MMP9介导细胞外基质重建提高HA/SR的细胞相容性，EF1β对γ-actin的调节介导的细胞骨架重排也在HA/SR表面细胞相容性提高中发挥重要作用。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 HA／SR的生物相容性检测和生物安全性评价

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 OPN在HA／SR表面的吸附情况研究

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 OPN在HA／SR表面细胞粘附中的重要桥梁作用研究

4．1 材料与方法

4．2 实验结果

4．3 讨论

4．4 小结

第五章 HA／SR细胞相容性提高的分子机制研究

5．1 材料与方法

5．2 实验结果

5．3 讨论

5．4 小结

全文讨论

全文总结

参考文献

文献综述一 生物医用材料和组织工程技术在组织修复中的新进展

文献综述二 乳房假体的发展现状及主要挑战

攻读博士期间取得的代表性成果

致谢