低强度超声联合微泡开放大鼠血脑屏障的研究

摘要

背景：
　　微泡介导增强的超声空化效应被广泛应用于多种疾病治疗的基础研究，主要包括:基因转染、微泡载药释放、增强溶栓效应、肿瘤治疗、开放血脑屏障(Blood-brain barrier，BBB)等。其中，超声激励微泡可短暂性开放BBB，促进药物跨BBB脑实质内的释放，具有巨大的科研价值和潜在的临床应用前景。
　　Hynynen等使用脉冲式聚焦超声激励微泡造影剂(Optison)，对实验动物兔和大鼠进行了超声空化效应开放BBB的研究，研究结果显示，可在局部有效的开放BBB通透性。以往研究中，缺乏关于不同峰值负压（简称声压）水平调控BBB通透性的研究，以及在单侧性、双侧性开放BBB方面的研究。声压是超声空化发生和强度最为相关的声学参数，因此，对BBB的通透性开放程度可能最相关。考察声压因素对超声开放BBB的影响，对于掌握适当治疗参数，避免副作用发生至关重要。随着超声空化效应在开放BBB研究中的深入，微泡造影剂作为外源性空化核，对开放BBB产生和发挥的生物学效应的机制也得以深入了解。激励微泡的空化效应主要分为两种:一种为稳态空化(stable cavitation)，另一种为惯性空化(inertial cavitation)。前者为微泡在低声压声场中，发生稳定规律的对称性的振荡，引起的声微流（microstreaming）、剪切力(shearforce)等。后者为在较高声场下，微泡负压相迅速膨胀，正压相突然收缩，交变周期性振荡甚至崩裂，此动力学过程可产生冲击波、微射流及发电、发光等极端的物理效应，其中通过冲击波和高速射流等效应在血管内皮细胞膜上形成微小孔，可增加细胞和组织屏障的通透性，还可实现细胞对大分子药物的俘获和摄取，此称之为“声孔效应”。
　　目的：
　　基于以上存在的问题，实现超声激励微泡在可调控性的开放BBB的关键因素，是如何正确的调控超声激励微泡的超声空化效应的强度和相关的生物学效应。
　　1.探讨采用超声空化仪的不同声压强度激励微泡空化，调控BBB开放程度的可行性，并初步研究安全、有效开放BBB的声压范围。
　　2.探讨采用诊断超声固定机械指数激励微泡空化，在选择性（单侧性或者双侧性）开放BBB通透性的可行性，有效性及安全性。
　　方法:
　　1.超声空化仪的不同声压值水平(43-708 kPa)激励微泡，用伊文思蓝(Evans blue，EB)示踪剂观察评价有效开放范围和程度，初步探索安全、有效，可调控性开放BBB的声压范围。
　　2.诊断超声的固定机械指数激励微泡，用EB示踪剂观察BBB有效开放范围和程度，初步探索开放单侧、双侧BBB的安全、有效机械指数和微泡剂量。
　　3.两种不同超声模式下，对激励微泡超声空化处理的安全性进行评价，实验动物神经功能行为学评价，内容包括:平衡木试验、网屏试验、前置放置试验，综合评价辐照处理前、后神经功能行为学是否产生影响及变化趋势。
　　4.以参与组成BBB主要结构的星形胶质细胞，损伤时可特异性表达的S-100B蛋白水平作为BBB损伤程度的评价指标，采用ELISA双抗体夹心法测定血清中S-100B蛋白含量水平的变化情况。
　　5.脑组织石蜡切片HE染色，对脑组织病理学结构变化进行观察，客观评价脑组织损伤范围和等级程度。
　　6.硝酸镧作为BBB通透性改变的示踪剂，透射电镜下观察BBB超微病理学结构的变化，以了解开放BBB通透性在细胞分子结构上发生的主要机制。
　　结果：
　　1.超声空化仪在不同声压值水平(43-708 kPa)激励微泡空化，可实现对大鼠单侧BBB可调控性的开放。伊文思蓝半定量值，从1.83±0.04μg/g(86 kPa)到10.56±0.13μg/g(708 kPa)，组间差异均有统计学意义（P＜0.01），反映BBB开放范围、程度与峰值负压呈线性正相关（R2=0.96）。BBB功能损伤蛋白(S-100B)定量值，提示最高值1.93±0.03 ng/L（对应708 kPa）为低损伤。脑组织病理损伤、神经功能行为学评价为可逆性。镧示踪剂也提示，BBB通透性随着声压增加，呈可调控性开放。
　　2.诊断超声在不同机械指数(1.2、1.3)激励微泡空化，通过声窗与探头长、短轴切面(28 mm×20 mm、15 mm×25 mm)、角度（∠15°～30°、∠90°±5°）的转换，可实现对正常大鼠单侧性、双侧性BBB通透性的开放。脑组织伊文思蓝半定量值显示，单侧开放时开放侧（9.85±0.75μg/g）EB漏出比对照侧(2.69±0.72μg/g)高约73％，双侧BBB开放则两侧比较无显著性差异（P＜0.05）。48 h以内BBB功能损伤蛋白(S-100B)蛋白定量值，单侧(0.36±0.02 ng/L)、双侧(0.68±0.45 ng/L)，监测最高值反映血脑屏障功能为低损伤。脑组织HE染色、神经功能行为学评价为可逆性。镧示踪剂提示，BBB通透性呈增强开放，弥散分布于脑组织内。
　　结论:
　　超声空化仪及诊断超声激励微泡的空化效应,可实现对BBB通透性可调控性的开放。主要的病理机制是促进BBB内皮细胞层紧密连接增宽，基底膜层通透性增加，从而实现可调控的增加BBB通透性开放。

目录

声明

英文缩写词一览表

摘要

第一章 前言

参考文献

第二章 超声空化仪联合微泡调控血脑屏障开放的研究

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三章 诊断超声联合微泡调控血脑屏障开放的研究

引言

实验一 单侧性开放血脑屏障的实验研究

材料与方法

结果

实验二 双侧性开放血脑屏障的实验研究

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

全文总结

文献综述 超声激励微泡可调控性开放血脑屏障的研究进展

攻读硕士学位期间发表文章及发明专利

致谢