SREBP-1c在白藜芦醇预防大鼠非酒精性脂肪肝发生中的作用

摘要

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，包含一系列从简单的脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎等临床症状，甚至肝硬化[1，2]。在西方国家，NAFLD占据大多数的慢性肝病，有近30％的成年人和大多数肥胖人患有[3，4]。虽然大量的研究已经进行，但NAFLD的具体病理原因仍然在很大程度上未知[5]。一种改进的“二次打击”模式已经总结出NAFLD的引发和进展，其中胰岛素抵抗被认为是对肝脏的“一次打击”，并导致接下来的打击，包括氧化应激，炎症，纤维化和细胞凋亡的发生[6]。
　　经全面汇总分析[7]和详尽的审查[8]，NAFLD的治疗仍存在争议。各种药理学方法已被探索，主要侧重于减轻重量，或者通过单纯的生活方式干预或与药物治疗相结合。然而，除了持续减重，没有其他单独的介入已经证明了对NAFLD的治疗有明确的显著疗效[9，10]，这突出表明，需要新的方法用于NAFLD的预防和治疗。
　　白藜芦醇（3，4'，5-三羟基二苯乙烯）是一种自然的酚类化合物，存在于某些水果、蔬菜和饮料中，包含红葡萄酒。已有报告显示白藜芦醇具有很多的生物健康益处，包括抗氧化、抗衰老、抗癌症、诱导自噬作用以及改善脂质代谢[11，12]。在最近的动物研究中，白藜芦醇显示出很有前景的效果在于保护肝脏抵抗高脂饮食诱导的脂质积聚[13-16]。其作用机制可能是通过单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)抑制脂肪生成的相关基因(如固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)和脂肪酸合成酶(FAS))来预防和改善肝脏脂肪变性，最后，降低肝脂肪酸利用率。在NAFLD的这些动物模型中，动物发展为肝脏炎症，白藜芦醇的抗炎潜力被认为是该作用效果的核心机制。然而，更多的可能机制还是一个未知数。在本研究中，通过提高肝脂质积聚的大鼠模型，我们探索白藜芦醇在防治NAFLD方面的潜力，并深入探讨白藜芦醇对AMPK、SIRT1、SREBP-1c、FAS等基因表达的影响以及对转录因子SREBP-1c的转录活性的影响。
　　8周龄雄性SD大鼠110只随机分为4组:基础饲料对照组((C1，n=20)，高脂膳食组(HF1，n=70)，高脂膳食加每天每kg体重50 mg RSV组(HF1RS0，n=10)和高脂膳食加每天每kg体重100 mg RSV组(HF1R100，n=10)。8周后，每组十只大鼠实施安乐死并取出肝脏和血液做后续分析。剩余HF1组大鼠被随机分成六组，每组十只大鼠:基础饲料对照组(HFC2)，高脂膳食组(HF2)，高脂膳食加每天每kg体重50 mg RSV组(HF2R50)，高脂膳食加每天每kg体重100 mg RSV组(HF2R100)，基础饲料加每天每kg体重50 mg RSV组(HFC2R50)，基础饲料加每天每kg体重100 mg RSV组(HFC2R100)。继续喂养8周后，所有大鼠实施安乐死并取出肝脏和血液做后续分析。每周称量动物体重和食物消耗量，干预后检测血清和肝脏中脂质含量，肝脏组织HE染色观察脂肪变情况，Western blot检测pAMPK、SIRT1、SREBP-1c、FAS的蛋白表达以及实时定量PCR分析SREBP-1c和FAS mRNA表达，ChIP试验分析FAS启动子序列SRE与SREBP-1c的结合程度。
　　结果:
　　1.RSV干预对大鼠摄食量和体重的影响
　　通过8周的干预，HF1组大鼠体重显著重于C1组(P＜0.05），由基础饲料转为高脂饲料后，大鼠的摄食量出现了不同程度的下降，说明大鼠对不同能量密度和营养素组成的食物有相应的识别和自我调节能力，而RSV干预在不影响大鼠每日能量摄入的情况下能使高脂饲养大鼠体重下降（P＜0.05）。但50mg和100mg RSV干预未观察到剂量效应关系。
　　2.RSV对大鼠脂代谢影响
　　脂代谢紊乱被普遍认为是NAFLD的根本。 HF1组大鼠血清和肝脏中TC和TG的浓度显著增加(P＜0.05)，而RSV干预能显著削弱高脂膳食所引起的TG含量的升高（P＜0.05），但RSV对TC的影响较小。
　　3.白藜芦醇能有效的减轻高脂诱导的NAFLD肝脏脂肪变性
　　由高脂饮食诱导8周后，HF1组大鼠肝脏出现了大量的脂肪沉积，表明NAFLD的模型建立成功。为了评价白藜芦醇对NAFLD进展的预防效果，在给予高脂饮食的同时用白藜芦醇干预，白藜芦醇能够显著降低高脂膳食引起的肝细胞脂肪滴的沉积。进一步为了研究白藜芦醇是否对NAFLD具有治疗作用，将高脂喂养8周NAFLD建模成功的大鼠随机分成六组:基础饲料对照组(HFC2)、高脂膳食组(HF2)、高脂膳食RSV组(HF2R50、HF2R100)、基础饲料加RSV组(HFC2R50、HFC2R100)，继续喂养8周后，HF2组大量的肝细胞脂肪变性，且具有明显气球样变。HF2组的NAS量化评分显著高于C2组，HF2组的小叶内炎症和纤维化程度非常高;HFC2组的NAS量化评分显著低于HF2组，HFC2组的纤维化程度明显降低了;HFC2R50和HFC2R100组的NAS量化评分显著低于HFC2组，特别是HFC2R50和HFC2R100组的小叶内炎症明显改善;HF2R50和HF2R100组的NAS量化评分显著高于HFC2R50和HFC2R100组，它们的脂肪变性和小叶内炎症情况相对严重;但只要添加了白藜芦醇干预或者从高脂膳食转变为正常膳食，都会改善肝脏脂肪变性程度。NAS量化评分与H&E染色结果是一致的。这些结果表明，白藜芦醇有效地改善由高脂饮食诱导的肝脂肪变性。
　　4.白藜芦醇诱导SD大鼠肝脏中AMPK的激活，增加SIRT1的表达水平
　　为了验证白藜芦醇对肝脏的保护效应是否通过AMPK和SIRT1信号通路，进一步检测肝脏组织中AMPK和SIRT1的蛋白表达量。结果显示:高脂喂养SIRT1的蛋白表达水平、AMPK-Thr172位点的磷酸化水平显著降低，白藜芦醇干预后能够有效逆转蛋白水平的降低。
　　5.白藜芦醇抑制SREBP-1c基因表达
　　为了检验白藜芦醇干预可能抑制NAFLD大鼠肝脏中过度活跃的SREBP-1c，我们检测了SREBP-1c的蛋白表达，在NAFLD大鼠肝脏中SREBP-1c的积累被白藜芦醇干预后显著减少。在HF饮食下肝脏SREBP-1 c的mRNA水平被显著增加，并且这种作用完全被白藜芦醇逆转。这些结果表明，白藜芦醇下调肝脏SREBP-1c表达，从而减少肝组织TG合成。
　　6.白藜芦醇抑制SREBP-1c表达，抑制SREBP-1c的转录活性及其靶基因的表达
　　为了确定通过白藜芦醇干预抑制SREBP-1c后的结果，通过Western印迹法，定量RT-PCR和ChIP实验评估SREBP-1c在肝脏中的关键靶点FAS基因的表达。白藜芦醇显著抑制FAS的启动子SRE与SREBP-1c的结合程度。FAS的mRNA和蛋白的表达改变均与SREBP-1c的改变相一致。这些数据表明，白藜芦醇抑制SREBP-1c而改善脂肪肝至少一部分通过抑制SREBP-1c的自动循环调节和降低其靶基因的表达。

目录

声明

缩略语表

摘要

1．前言

2．材料与方法

2．1 主要试剂

2．2 主要仪器

2．3 主要检测指标及实验方法

2．4 统计分析

3．结果

3．1 RSV干预对大鼠摄食量和体重的影响

3．2 RSV对大鼠脂代谢影响

3．3 白藜芦醇能有效的减轻高脂诱导的NAFLD肝脏脂肪变性

3．4 白藜芦醇诱导SD大鼠肝脏中AMPK的激活，增加SIRT1的表达水平

3．5 白藜芦醇抑制SREBP-1c基因表达

3．6 白藜芦醇抑制SREBP-1c表达，抑制SREBP-1c的转录活性及其靶基因的表达

4．讨论

全文结论

参考文献

文献综述 白藜芦醇防治非酒精性脂肪性肝病的研究进展

读硕士学位期间发表的学术论文

致谢