黄曲霉毒素和微囊藻毒素联合暴露与肝肾损伤关系的人群和机制研究

摘要

黄曲霉毒素(AFT)和微囊藻毒素(MC)普遍存在于湿热的气候条件区域，人们主要通过被污染的食物和饮水造成AFT和MC的暴露。在一些发展中国家（包括中国），AFT和MC的污染现象十分普遍，并且两个毒素在这些区域往往同时存在。目前大量的实验室研究已经表明AFT和MC均会对机体造成明显的肝、肾损伤。然而AFT和MC暴露后对肝、肾的损伤作用比较及两者联合暴露对肝、肾的损伤作用效应还缺乏相关的流行病学研究和机制研究。
　　我们前期研究已经发现三峡库区存在一定程度的AFT和MC污染。因此，本课题第一部分在三峡库区AFT和MC暴露区域建立研究人群，获取他们的基本生活习惯、饮食饮水习惯、疾病家族史和健康资料等信息。第二部分利用人群的基线资料和健康体检结果，初步探讨两个毒素单独或联合暴露对无HBV感染和有HBV感染人群的肝损伤作用。第三部分同样利用人群的基线资料和健康体检结果，初步探讨两个毒素单独或联合暴露在人群中的肾损伤作用。第四部分在细胞层面，探讨两种生物毒素单独或联合暴露对L02细胞活性氧的影响及由此产生的DNA氧化损伤作用。
　　第一部分、三峡库区黄曲霉毒素和微囊藻毒素暴露人群研究现场的建立
　　一、方法:
　　1、研究区域的选择
　　2、研究人群的建立
　　3、两个镇外环境中AFB1和MC-LR的检测
　　4、病毒性肝炎的检测
　　5、血清肝、肾功能指标的检测
　　6、统计分析
　　二、结果:
　　1、研究区域AFB1和MC-LR污染情况
　　MC-LR的检出率为68.70％(90/131)，浓度从0.02-1.74μg/kg。在所有检测样本中，义和镇井水、末梢水以及水体的均值MC-LR浓度均显著性高于李渡镇;义和镇鸭肉及水产品均值MC-LR浓度均显著高于李渡镇。
　　AFB1的检出率为42.24％(145/344)，浓度从0.04-4.87μg/kg。在所有检测样本中，大米、玉米、花生、豆瓣酱、辣椒检出AFB1的浓度较高。十三种样品和总均值在两个镇之间没有显著性差异。
　　2、研究人群流行病学特征
　　共完成6467人的流行病学调查表填写或临床标本检测，其中同时完成调查表和肝、肾损伤检测的人数为5493人。两个镇年龄、性别、教育程度、收入、吸烟、被动吸烟以及药物使用方面具有显著性差异;两个镇在BMI、民族、出生地、饮酒方面没有显著性差异。
　　3、研究人群健康特征
　　研究人群中肝功能指标ALP、AST、ALT和GGT异常率百分比分别为3.44、10.16、4.81和9.92;肾功能指标肌酐、尿素氮和eGFR的异常率百分比分别为4.50、6.97和2.35;代谢相关指标Tch、Tg和Glu的异常率百分比分别为16.12、24.84和9.40。
　　三、结论:
　　本研究发现涪陵地区生活的居民存在AFB1和MC-LR的暴露;两个镇具有不同的AFB1和MC-LR暴露水平以及肝肾功能水平，提示AFB1和MC-LR可能是两个镇肝肾功能水平差异的重要原因。
　　第二部分、三峡库区人群HBV、AFB1和MC-LR暴露与成人肝损伤关联性的横断面分析
　　一、方法:
　　1、人群暴露情况的计算
　　2、两个镇人群肝功能酶、HBV感染、AFB1和MC-LR暴露情况比较
　　3、所有研究人群中，三种危险因素单独暴露与肝功能酶指标关系的比较及联合毒性效应分析
　　4、统计分析方法
　　二、结果:
　　1、HBV DNA、EDIAFB1、 EDIMC-LR以及肝功能酶的相关性
　　AST及ALT均与HBV DNA水平、EDIAFB1以及EDIMC-LR显著性相关(P＜0.05)，并且与AST和ALT的相关系数均显示为HBV＞EDIMC-LR＞EDIAFB1。ALP和GGT只与EDIMC-LR显著性相关(P＜0.05)，与HBV DNA水平、EDIAFR1均不具有相关性(P＞0.05)。
　　2、HBV、AFB1和MC-LR单独暴露与肝功能的效应比较
　　HBsAg(+)人群AST和ALT的均值均显著高于HBsAg(-)，并且HBV DNA(≥100IU/mL)的人群AST和ALT的均值升高的更为明显。另外，与HBsAg(-)人群相比，HBsAg(+)人群和HBV DNA(≥100 IU/L)人群AST和ALT的OR值均显著升高，HBV(+)人群和HBV DNA(≥100 IU/L)的人群AST的OR值分别为2.413(95％CI=1.701-3.424)和5.322(95％CI=3.535-8.014);ALT的OR值分别为2.974(95％CI=2.009-4.403)和5.322(95％CI=3.535-8.014)。
　　具有高分位数EDIAFB1和EDIMC-LR的人群，相比低分位数EDIAFB1和EDIMC-LR的人群，AST和ALT的均值均显著升高;但是相应的OR值并没有显著性变化。
　　3、三个危险因素相互之间的协同作用比较
　　在HBV(-)人群中，相比较AFB1和MC-LR都低暴露的人群，AFB1和MC-LR都高暴露的人群的AST和ALT的均值都显著升高，但是AST和ALT的OR值均没有显著升高。相比较HBV(-)人群，在不同的AFB1或MC-LR的暴露人群当中，HBV均能显著增加人群AST和ALT的均值以及OR值，尤其是在HBV DNA≥100mL的人群中，升高的情况更为明显。两个毒素低暴露的人群，矫正后的AST和ALT的OR值分别为4.647(2.253-9.585)和5.504(2.457-12.328);两个毒素高暴露的时候，矫正后的AST和ALT的OR值分别为16.402(4.862-55.340)和18.052(4.968-65.597)。
　　三、结论:
　　在三个肝损伤危险因素中，HBV是最主要的肝损伤危险因素，并且HBV能够增加AFB1和MC-LR肝损伤的危险性，控制HBV感染可能是预防人群环境毒素损害的重要手段。
　　第三部分、三峡库区人群AFB1和MC-LR暴露与成人肾损伤关联性的横断面分析
　　一、方法:
　　1、人群肾功能指标异常情况与毒素的暴露量的关系分析
　　2、人群AFB1和MC-LR毒素单独暴露与肾功能指标关系的比较及联合毒性效应分析
　　3、统计分析
　　二、结果:
　　1、毒素单独暴露与肾功能的关系比较
　　具有较高MC-LR暴露的人群，其血清中Cr、BUN均值升高、eGFR均值降低，且三个指标异常率的OR值分别为Scr(OR=4.58，95％CI=2.92～7.21)，BUN(OR=1.80，95％CI=1.34～2.42)和eGFR(OR=4.41，95％CI=2.55～7.63);而对于不同AFB1暴露水平的人群中，并没有发现Cr和BUN，eGFR具有显著性差异。
　　2、两个毒素联合暴露与肾功能的关系
　　联合暴露组的人群，一旦MC-LR处于高暴露，无论AFB1暴露高低情况如何，三个肾功能指标的OR值均显著升高，所有结果表明MC-LR可能是造成人群肾功能损伤的主要因素。相比较联合低暴露组，两个毒素高暴露组人群异常的Cr、BUN和eGFR的OR值分别为1.46(95％CI=1.10-1.94)、2.92(95％CI=1.96-4.36)和2.92(95％CI=1.66-5.16)。
　　三、结论:
　　MCs是重要的肾损伤危险因素，AFB1对肾损伤的作用并不显著，人群联合暴露于两个毒素后损伤效应均表现为MCs的肾损伤作用，控制MCs的暴露对人群慢性肾疾病的预防具有重要作用。
　　第四部分、黄曲霉毒素和微囊藻毒素联合暴露致L02细胞DNA氧化损伤及氧化应激改变的研究
　　一、方法:
　　1、AFB1和MC-LR暴露与DNA氧化损伤的关系
　　2、AFB1和MC-LR暴露与氧化应激的关系研究
　　3、统计分析
　　二、结果:
　　1、AFB1和MC-LR联合暴露对L02细胞遗传毒性
　　随着两者联合毒性剂量的增加，细胞尾部DNA百分比及微核形成率均显著升高。联合高剂量组(AFB110mg/L联合MC-LR10mg/L)染毒组微核形成率和尾部DNA百分比分别为41.33±7.78％和18.19±15.06％，而对照组(DMSO组)微核形成率和尾部DNA百分比分别为5.00±2.00％和1.03±0.59％。
　　2、AFB1和MC-LR联合暴露对L02细胞ROS表达的影响
　　在较低剂量时，随着两种毒素联合剂量的增加，ROS的表达逐渐升高;在较高剂量时，随着两种毒素联合剂量的增加，ROS的表达逐渐降低。
　　三、结论:
　　AFB1和MC-LR联合染毒对肝细胞具有协同致DNA损伤作用，其重要机制是造成细胞ROS的改变。
　　全文总结:
　　本研究发现涪陵地区生活的居民存在AFB1和MC-LR的暴露，并且是两个镇肝肾损伤的重要原因;相比较AFB1和MC-LR而言，HBV仍然是最主要的人群肝损伤危险因素，并且HBV会显著增加AFB1和MC-LR造成的肝损伤;MCs是最主要的肾损伤危险因素，AFB1肾损伤并不明显，两者联合后主要表现为MCs引起的肾损伤;AFB1和MC-LR具有协同致肝L02细胞DNA损伤的效应，其主要机制之一是通过导致细胞ROS改变。

目录

声明

英文缩写一览表

摘要

前言

第一部分 三峡库区黄曲霉毒素和微囊藻毒素暴露人群研究现场的建立

1．1 材料与方法

1．2 结果

1．3 讨论

第二部分 三峡库区人群乙型肝炎病毒感染、黄曲霉毒素和微囊藻毒素暴露与成人肝损伤的关联性研究

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三部分 三峡库区人群AFB1和MC-LR暴露与成人肾损伤的关联性研究

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

第四部分 黄曲霉毒素和微囊藻毒素联合染毒致L02细胞氧化应激改变及DNA氧化损伤的研究

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述 微囊藻毒素人体生物标志物研究进展

附录

在读期间发表及完成的论文

致谢