低氧对牙周膜干细胞干性作用：自我更新功能以及多能性的研究

摘要

牙周病(periodontal diseases)是人类口腔两大类主要疾病之一,具有发病率高，危害严重的特点。在世界范围内均有较高的患病率,在我国患病率更居于龋病之上。牙周炎会导致牙龈炎症、牙周组织破坏、牙槽骨的吸收、最终导致牙齿脱落。是人群中导致失牙的主要原因。我国是世界上高原面积最大、居住人口最多的国家，高原地区占国土面积的六分之一；而目前,国内外关于高原环境下牙周炎的发病机制研究报道少见。本课题组在前期对高原地区驻地官兵进行了流行病学的调查，结果显示：受调者牙周炎患病率在60％，这种高发病率明显高于平原地区，涉及的原因可能是：高原低氧环境；口腔自洁效果差，利于菌斑形成；牙周微循环障碍，PH值下降等多因素所导致的，这不仅使高原人群成为牙周炎易感人群，同时，也影响了牙周炎患者牙周组织的再生与修复。
　　牙周膜干细胞（PDLSCs），一组牙周膜组织来源的间充质干细胞，分离自牙周组织，是牙周组织的主要功能细胞。作为牙周组织炎症中重要的靶细胞及牙周修复的重要种子细胞，对PDLSCs的研究具有重要的临床意义。高原环境空气稀薄、含氧量低,特别高海拔地区的低氧条件下,会导致机体组织不同程度缺氧,而缺氧又是机体最常见的病理生理过程。研究表明:机体对缺氧的反应实本实验观察了载缺氧条件下对体外PDLSCs增殖、克隆、多向分化的生物学效应的影响,同时也研究了所涉及的潜在机制，为高原牙周病的机制研究进一步研究提供实验依据。
　　目的：观察缺氧对体外培养的人牙周膜干细胞(HPDLSCs)增殖、克隆、干细胞标志、多向分化的生物学活性的影响，以及潜在机制的研究。
　　材料和方法：临床收集健康人的第三磨牙牙周膜组织，用连续稀释法分选培养出PDLSCs，经增殖、克隆形成、干细胞标志、成骨性及成脂性等方面对原代培养的HPDLSCs进行鉴定。体外模拟低氧环境，并将PDLSCs分别培养于低氧（5%O2）和正常氧条件（20%O2），比较不同氧浓度下PDLSCs生物学活性的变化。
　　1．MTT比色法检测低氧对PDLSCs增殖能力的影响。
　　2．细胞计数检测低氧对PDLSCs单克隆的能力。
　　3．ELISA检测低氧对PDLSCs成骨标志ALP活性的影响，实时定量荧光PCR技术检测成脂标志基因PPARγ和LPL的表达，从而评价低氧条件下对PDLSCs成骨、成脂能力的影响。
　　4．在这些研究的基础上，进一步检测了低氧条件下PDLSCs生物学活性变化所涉及的分子信号机制，采用 Western Blot检测低氧条件下对 PDLSCs p38/MAPK和ERK/MAPK信号的影响；并利用特异性的阻断剂，分别阻断p38或ERK信号后，观察阻断这些信号后对低氧条件下培养的PDLSCs的影响。
　　结果：
　　1．采用有限稀释法从健康人第三磨牙的牙周膜组织中，成功分离培养出PDLSCs，并进行了鉴定。PDLSCs呈典型“梭型”细胞形态，并阳性表达STRO-1、CD44和CD146；具有较强的克隆形成能力以及增殖功能。
　　2．在不同的培养条件下对PDLSCs进行定向诱导，PDLSCs能够具有成骨性分化和成脂向分化的能力。
　　3. PDLSCs可在低氧浓度条件下维持其干细胞标记物表达，包括STRO-1、CD146、CD44和CD45。低氧可增强PDLSCs的克隆形成能力和增殖能力。低氧组PDLSCs的ALP活性明显高于常氧组。低氧组中与成脂相关的基因PPARγ和 LPL的相对倍数变化明显下调。低氧条件下能显著上调 PDLSCs的p38/MAPK和ERK1/2的磷酸化水平。此外，低氧条件下，无论单独还是联合运用P38抑制剂和ERK抑制剂，都会显著抑制PDLSCs增殖和克隆形成能力；单独运用P38抑制剂会显著抑制ALP，PPARγ和LPL的表达，单独应用ERK抑制剂显著刺激了ALP， PPARγ和LPL的表达，然而，二者联合运用却显著上调了ALP，PPARγ和LPL的表达。
　　结论： PDLSCs在低氧条件下可以维持其自我更新能力，包括克隆和增殖能力。但是低氧条件下PDLSCs的成骨分化潜能和成脂分化潜会受到明显的抑制。而这一变化同时涉及到了p38/MAPK和ERK/MAPK通路，在低氧条件下PDLSCs增殖和分化等功能起着重要的调控作用。

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缩略语表

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第一章 前 言

第二章 牙周膜干细胞的分离、培养和鉴定

2.1 材料与方法

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 低氧对牙周膜干细胞干性作用包括克隆、增殖和多向分化的作用

3.1 材料与方法

3.2 方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 低氧对牙周膜干细胞干性作用调控的分子信号机制

4.1 材料与方法

4.2 方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

全文总结

一、取得的研究成果

二、需要进一步研究或改进的问题

参考文献

文献综述一缺氧在干细胞多潜能和分化中的作用

文献综述二牙周膜干细胞的研究进展

附件：攻读博士期间发表的文章

个人简历

攻读博士期间发表的文章

致谢