SIRT1在血管平滑肌源性泡沫细胞迁移中的作用和机制研究

摘要

背景和目的:动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)因可引起缺血性心脏病、脑卒中和外周血管疾病等高发病率和高致死率的疾病而成为全世界范围内人口死亡的首要原因。胆固醇酯和甘油三酯等中性脂肪以脂滴的形式存在于血管壁细胞内形成泡沫细胞(foam cells，FC)。FC形成脂质条纹以至粥样斑块是AS早期的关键病理环节。既往研究广泛认为AS中FC的主要本源是巨噬细胞。与此同时，AS中还大量存着血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)来源的FC，中晚期病变中尤为显著。值得关注的是，VSMC源性FC主要位于内皮下而不是VSMC通常所在的中膜。因此，从中膜向内膜的迁移是VSMC摄取中性脂质发生泡沫样变不可缺少的一步。VSMC的迁移先于还是与FC的形成同步发生并不十分清楚。氧化型低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein，oxLDL)通常认为是最强的致AS因子，且在体内体外研究中皆证实可以促进VSMC发生泡沫化。本研究的目的就是探究oxLDL诱导VSMC源性FC形成过程中迁移能力的改变以及所涉及的分子机制。
　　去乙酰化酶1(sirtuin1，SIRT1)是哺乳动物内与酵母菌的沉默信息调控因子2（silent information regulator2，Sir2）同源的蛋白，是组蛋白去乙酰化酶成员之一。SIRT1可以靶定许多下游蛋白从而影响多种病理生理过程，这些蛋白包括:过氧化物酶体增殖物活化受体（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）-γ、PPAR-γ辅助激活因子(PPAR-γ coactivator)-1α、解偶联蛋白(uncoupling protein)-2、肝X受体（liver X receptor，LXR）和核因子(nuclear factor，NF)-κB等。SIRT1使LXR去乙酰化后可以上调后者的活性，并促进胆固醇逆转运将胆固醇从细胞内排出，最终抑制巨噬细胞源性FC的形成。SIRT1可以通过抑制早衰而防止内皮功能紊乱。SIRT1还可以上调内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）而改善因高脂饮食受损的血管舒张功能。此外，在稳定斑块、降低胆固醇摄取、抑制巨噬细胞泡沫化以及减轻炎症反应等方面的积极作用使SIRT1成为防治AS的新靶标。然而SIRT1在泡沫化过程中对VSMC迁移的作用却罕有研究报道，因此成为本研究重点探讨的问题。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是锌离子依赖的，可以降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)中许多组分的蛋白水解酶。MMP-9，也被称为明胶酶B，在AS不稳定斑块中高度表达。MMP-9是VSMC迁移的标志性蛋白。以往的研究证实MMP-9过度表达能够诱使VSMC迁移至血管内膜，而MMP-9-/-小鼠的血管损伤后VSMC迁移和血管损害的程度则明显降低。因此，本研究也检测了MMP-9的表达以及其潜在调控因子的变化，希望明确VSMC源性FC形成过程中迁移的的分子机制。
　　瞬时受体电位香草醛亚家族1(Transient receptor potential vanilloid subfamilymember1，TRPV1)已被证实在改善心脑血管疾病(cardiovascular and cerebrovasculardiseases，C-CeVD)方面有显著作用。多项研究显示激活TRPV1可通过代谢或自噬等途径减少VSMC内的脂质堆积从而抑制FC的形成。我们前期的研究也证实了激活TRPV1可抑制自发性高血压大鼠轻度炎性的VSMC的增殖。然而，TRPV1在VSMC迁移方面作用的研究很少。本研究中我们探讨了TRPV1在VSMC源性FC迁移和MMP-9表达方面的作用，并试图了解SIRT1在其中的关键角色，从而希望丰富TRPV1在防治动脉粥硬化方面的保护机制。
　　材料与方法:
　　1.采用组织块贴壁法原代培养雄性C57BL/6J野生型(wild type，WT)小鼠胸主动脉VSMC，并利用免疫荧光和流式细胞技术标记细胞内α平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscle actin，α-SMA)进行VSMC鉴定。
　　2.oxLDL诱导VSMC形成FC，并利用油红O染色和异丙醇萃取法测定细胞内脂质以鉴定FC。
　　3.Transwell实验检测细胞迁移能力。
　　4.SIRT1激活剂SRT1720(SRT)和拮抗剂尼克酰胺（nicotinamide，Nic）用来调控SIRT1的表达。
　　5.TRPV1激活剂辣椒素(capsaicin，Caps)和拮抗剂辣椒卓平（capsazepin，Capz）用来调控TRPV1的表达。
　　6.蛋白免疫印迹(Western blot)和免疫荧光分别定量和定性地检测相关蛋白的表达。
　　结果:
　　1.VSMC源性FC的形成伴随着迁移能力和MMP-9蛋白表达的增加。
　　本研究中，油红O染色发现80μg/mL的oxLDL促进了原代培养的VSMC细胞内红色脂滴的堆积，同时细胞内的脂质含量也显著增高，明确了oxLDL可以诱导VSMC发生泡沫样变而形成FC。Transwell实验结果显示，oxLDL刺激的VSMC与空白对照组细胞相比迁移能力明显增强，而且Western blot结果也表明MMP-9蛋白表达明显升高。
　　2.oxLDL降低了SIRT1蛋白的表达而促进了VSMC源性FC的迁移和MMP-9蛋白的高表达。
　　oxLDL刺激VSMC24小时后SIRT1蛋白的表达明显降低。本实验用SRT和Nic调控SIRT1蛋白的表达，SRT(1μM)可以上调WT-VSMC和oxLDL刺激的VSMC表达SIRT1，100μM的Nic显著降低了SRT上调的SIRT1。Western blot和Transwell实验结果显示相较于单独oxLDL作用，同时予以SRT刺激VSMC后可以上调SIRT1蛋白的表达和下调MMP-9蛋白的表达，而且该效应被SIRT1的拮抗剂Nic所阻断。
　　3.SIRT1可能通过抑制NF-κB信号通路而抑制VSMC源性FC迁移和MMP-9蛋白表达。
　　oxLDL刺激的VSMC表达磷酸化的IκBα(p-IκBα)和核内NF-κB p65蛋白明显增加。相较于单独oxLDL作用，同时予以SRT刺激VSMC后下调了p-IκBα和核内p65蛋白的表达，而且该效应被SIRT1的拮抗剂Nic所阻断。NF-κB抑制剂BAY11-7082也显著地降低了MMP-9蛋白的表达。
　　4.Caps激活TRPV1可抑制VSMC源性FC的迁移和MMP-9蛋白的表达。
　　分别应用TRPV1激动剂Caps和抑制剂Capz来调控TRPV1的表达。Caps呈浓度依赖性地增加TRPV1蛋白的表达而降低MMP-9蛋白的表达。相较于单独oxLDL作用，同时予以Caps刺激VSMC后可以下调MMP-9蛋白的表达和细胞的迁移，而且该效应被TRPV1的拮抗剂Capz所阻断。
　　5.Caps激活TRPV1可上调SIRT1蛋白的表达以及抑制NF-κB信号通路。
　　Caps激活TRPV1呈浓度依赖性地上调VSMC源性FCSIRT1的水平。与对照组相比，Caps刺激VSMC后可以上调SIRT1蛋白的表达，而且该效应被TRPV1的拮抗剂Capz所阻断;Caps刺激VSMC后也可以增加因oxLDL下调的SIRT1蛋白。与单独oxLDL作用相比较，同时予以Caps刺激VSMC后下调了p-IκBα和核内NF-κB p65蛋白的表达，而且该效应被Capz所阻断。
　　结论:本研究表明oxLDL诱导VSMC源性FC的形成伴随着细胞迁移能力和MMP-9蛋白表达的升高，且证实其与SIRT1的降低和NF-κB信号通路的增强有关。Caps激活TRPV1后可通过增强SIRT1表达和减弱NF-κB信号而抑制VSMC源性FC的迁移。泡沫化和表型转化是VSMC参与AS发生发展的关键环节。本研究表明SIRT1是改善VSMC功能的潜在干预靶标，并丰富了TRPV1在防治AS方面的保护作用。近年来的研究表明白藜芦醇等SIRT1的激活剂已经在AS动物和细胞模型中显示出了保护作用。即使临床结果并不稳定和一致，维持较高水平的SIRT1可能对防治AS有益。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 血管平滑肌源性泡沫细胞的形成与迁移能力的改变

分题一 体外血管平滑肌细胞的培养和泡沫细胞模型的制作

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

分题二 血管平滑肌源性泡沫细胞迁移能力的改变

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

全章小结

第三章 SIRT1调控血管平滑肌源性泡沫细胞迁移的作用和分子机制

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

分题二SIRT1调控血管平滑肌源性泡沫细胞迁移的分子机制

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

全章小结

第四章 SIRT1参与TRPV1调控血管平滑肌源性泡沫细胞迁移的作用和分子机制

分题一 TRPV1激活对血管平滑肌源性泡沫细胞迁移的作用

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

分题二 SIRT1参与TRPV1调控血管平滑肌源性泡沫细胞迁移的分子机制

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

全章小结

全文结论

参考文献

文献综述 1 An overview of potential molecular mechanisms involved in VSMC phenotypic modulation

文献综述 2 SIRT 1 improves VSMC functions in atherosclerosis

攻读学位期间的研究成果

致谢