sFRP5甲基化在硫酸吲哚酚诱导肾纤维化中的作用研究

摘要

肾纤维化是各种慢性肾脏病(Chronic Kideney Disease，CKD)发展为终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)的主要病理基础。肾纤维化以间质纤维化和肾小管扩张为特征，其严重程度与肾功能受损情况及患者肾脏疾病的预后有着非常密切的关系。截止目前，肾纤维化的发生机制并未完全阐明，因此，对该病理过程的深入研究具有非常重要的临床意义。
　　肾纤维化的发生与发展与多种因素有关，如炎症、氧化应激等，这些因素会导致肾脏固有细胞致纤维化因子分泌，造成肾小管上皮细胞转分化(EMT)及成纤维细胞增殖与活化，最终导致肾纤维化。而尿毒症毒素蓄积是CKD患者另一重要的临床特征，近年来，人们开始关注尿毒症毒素在CKD及其并发症中的作用，特别是蛋白结合毒素，如硫酸吲哚酚(IS)，对甲酚硫酸盐(PCS)，由于它们不能通过常规透析有效清除，可以在血液循环中长时间大量存在，对机体产生不良影响。晚近，我们和其他学者的研究均发现蛋白结合毒素IS可以促进肾纤维化，但截至目前，相关机制并未进行深入研究。
　　Wnt/β-catenin信号通路活化是导致肾纤维化的关键途径之一。在正常机体中，Wnt/β-catenin信号通路处于沉默状态，而肾脏损伤后，该通路被激活，使大量β-catenin进入细胞核内并与TCF/LEF形成β-catenin/TCF/LEF复合物，从而激活下游靶基因的转录，如纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)，纤连蛋白，成纤维细胞特异性蛋白1(FSP1)，Snail1，MMP-7等，最终导致肾纤维化的发生和发展。而在IS诱导肾纤维化的过程中Wnt信号通路是否参与其中并不明确。既往研究表明，Wnt信号通路活化与否与其内源性抑制因子有关，Wnt信号通路的内源性抑制因子包括分泌型卷曲蛋白家族(secreatedfrizzled-related proteins，sFRPs)和清道夫受体家族(Diekkopfs，DKKs)。其中，sFRPs家族有5个成员，即sFRP1-5，sFRPs蛋白N-端的卷曲样半胱氨酸富集区域与Wnt特异性Frizzlrd受体有30％-50％序列相似，它可通过该区域与Wnt结合，或与Frizzlrd受体相互作用形成无功能的复合物，从而封闭Wnt信号通路。而sFRPs表达降低可引起Wnt信号通路持续激活，导致β-catenin在胞内大量蓄积，进而激活Wnt信号的下游靶基因。众所周知，Wnt信号通路活化可以促进癌细胞增殖，而sFRPs启动子甲基化后的表达下调正是造成Wnt信号通路活化和癌症进展的重要机制之一。而引入关注的是，在尿毒症特有的内环境下，蛋白结合毒素可以通过多种表观遗传修饰方式调节基因表达，DNA甲基化就是其中非常重要的一种表观遗传修饰方式，并且，有研究证实IS确实可以诱导某些基因发生甲基化。为此，我们将在本研究中明确IS促进肾纤维化的作用是否与其诱导Wnt/β-catenin信号通路活化有关，并阐明sFRPs基因甲基化在此过程中是否发挥了关键作用，并探讨其中的可能机制，以期深入揭示肾纤维化的发生机理并为其防治提供新的干预靶点。
　　为此，本研究首先观察了CKD患者肾纤维化程度，IS血清浓度以及β-catenin表达之间的相关性;然后以人肾近曲小管上皮细胞（HK-2细胞）为体外研究对象，探讨IS诱导HK-2细胞Wnt/β-catenin信号通路激活的作用，并明确IS是否通过诱导sFRPs基因甲基化活化Wntβcatenin信号通路;最后，利用CD-1小鼠制备单侧肾切除模型，观察腹腔注射甲基化转移酶抑制剂5Aza-2dc或sFRPs重组蛋白对小鼠肾纤维化的影响，明确外源性补充sFRPs重组蛋白和甲基化转移酶抑制剂是否可以减轻IS诱导的肾间质纤维化。
　　主要研究内容及研究结果如下:
　　1.CKD患者血清IS浓度与肾脏β-catenin表达，肾间质纤维化程度呈正相关关系;
　　34例患者的eGFR与血清IS浓度、β-catenin表达和肾间质纤维化程度呈显著负相关，即患者的eGFR越低，血清IS浓度和β-catenin的表达越高，肾间质纤维化越重;相反，34例患者的血清IS浓度与β-catenin表达、肾纤维化程度呈显著正相关;提示患者血清IS浓度与β-catenin表达和肾间质纤维化程度有着密切关联。
　　2.在单侧肾切除CKD模型小鼠中，腹腔注射IS能够诱导肾间质纤维化并激活Wnt/β-catenin信号通路;
　　IS注射组小鼠血清IS浓度较对照组小鼠血清IS浓度增高5倍;Masson染色显示，与对照组相比，IS注射组小鼠肾间质胶原沉积明显增加;免疫组化和westem blot结果表明，与对照组相比，IS注射组小鼠β-catenin和α-SMA表达显著增加。上述结果表明，腹腔注射IS可以诱导单侧肾切除小鼠肾间质纤维化，该作用可能与其激活Wnt/β-catenin信号通路有关。
　　3.IS通过下调sFRP5表达激活Wnt/β-catenin信号通路;
　　IS对sFRP3和sFRP4 mRNA表达无明显影响，sFRP1和sFRP2在HK-2细胞表达极弱，但sFRP5 mRNA表达随着IS浓度的增加呈剂量依赖性降低;western blot结果同样表明，IS剂量依赖性的下调sFRP5表达。这说明IS可能通过抑制sFRP5表达激活了HK-2细胞Wnt/β-catenin信号通路。为了进一步明确上述结论，我们在CKD患者肾活检组织和腹腔注射IS的单侧肾切除小鼠肾组织中观察了sFRP5的表达情况，免疫组化染色结果表明，CKD5期患者肾脏sFRP5表达较正常肾脏组织明显减弱。免疫组化、RT-PCR和western blot检测发现腹腔注射IS的CKD小鼠肾脏sFRP5 mRNA和蛋白表达较对照组明显减弱。上述结果充分证实，IS通过下调sFRP5表达诱导了Wnt/β-catenin信号活化。
　　4.IS通过诱导sFRP5 DNA甲基化下调了sFRP5表达，导致了Wnt/β-catenin信号通路活化;
　　5.IS通过激活ROS/ERK1/2信号通路诱导sFRP5 DNA甲基化;
　　众所周知，IS能够促进多种细胞发生氧化应激，而氧化应激是DNA启动子CpG岛发生甲基化的一个主要诱发因素。为此，我们探讨了IS是否是通过诱导氧化应激并激活下游信号通路发挥致sFRP5 DNA甲基化的作用。DCFH-DA检测结果发现，IS可呈时间和剂量依赖性促进HK-2细胞内ROS生成;western blot结果显示，IS剂量依赖性的诱导p-ERK1/2表达增高。而5 mM ROS清除剂NAC和10μM ERK1/2抑制剂U0126预孵育HK-2细胞1h，均可明显抑制IS诱导的p-ERK1/2表达增高和sFRP5 DNA启动子甲基化。此外，NAC和U0126预孵育均能显著抑制IS诱导的DNMT1蛋白表达增加和sFRP5蛋白表达下降。以上结果提示IS通过激活ROS/ERK1/2信号通路，导致DNMT1表达增加，进而诱导了sFRP5 DNA甲基化，从而下调了HK-2细胞sFRP5的表达。
　　6.外源性补充5Aza-2dc能够明显抑制IS诱导的CKD模型小鼠肾组织sFRP5 DNA甲基化程度及sFRP5表达下调;
　　建立单侧肾切除CKD小鼠模型，腹腔注射IS的同时注射5Aza-2dc(0.35mg/kg/48h)，MSP检测各组小鼠sFRP5 DNA甲基化程度，结果发现，5Aza-2dc能够显著降低IS诱导的肾组织sFRP5 DNA甲基化程度。RT-PCR、免疫组化和western blot检测结果显示，5 Aza-2dc能够抑制IS诱导的sFRP5表达下调。因此，我们的体内研究进一步证实，IS可以诱导sFRP5 DNA甲基化，而sFRP5 DNA启动子甲基化很可能是IS诱导肾间质纤维化的关键机制。
　　7.腹腔注射sFRP5重组蛋白和5Aza-2dc明显抑制了IS诱导Wnt/β-catenin信号通路活化及肾间质纤维化。
　　为了明确sFRP5 DNA启动子甲基化在IS诱导Wnt/β-eatenin信号通路活化和肾间质纤维化中的作用，我们在给予CKD模型小鼠腹腔注射IS的同时注射不同浓度的sFRP5重组蛋白(0.02mg/kg/48h，0.01 mg/kg/48h)或5Aza-2dc(0.35 mg/kg/48h)，观察Wnt/β-catenin信号通路的活化情况和肾纤维化程度。Masson染色结果表明，外源性补充sFRP5重组蛋白或5Aza-2dc均可不同程度的减轻IS诱导的模型小鼠肾间质胶原沉积，免疫组化和western blot检测发现纤维化标志物α-SMA表达也明显降低。此外，外源性补充sFRP5重组蛋白或5Aza-2dc均可显著抑制IS诱导的β-catenin表达增高。我们分析认为，外源性补充sFRP5重组蛋白或者抑制sFRP5 DNA启动子甲基化均可削弱IS诱导的Wnt/β-catenin信号活化，改善肾间质纤维化。因此，sFRP5启动子甲基化是IS诱导肾间质纤维化的关键环节。
　　综上所述，本研究表明，IS通过激活ROS/ERK1/2信号通路，诱导了sFRP5 DNA启动子甲基化，导致sFRP5表达下调，进而活化Wnt/β-catenin信号，最终促进了肾间质纤维化的发生、发展。而外源性补充sFRP5重组蛋白或者使用甲基化转移酶抑制剂抑制sFRP5 DNA甲基化均可有效改善IS诱导的肾间质纤维化。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 Wnt／β-catenin信号通路活化与硫酸吲哚酚诱导肾纤维化的相关性研究

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 实验讨论

2．4 小结

第三章 sFRP5甲基化在硫酸吲哚酚诱导肾小管上皮细胞Wnt／β-catenin信号通路活化中的作用及机制研究

3．1 材料和方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 外源性补充sFRP5及其去甲基化对硫酸吲哚酚促肾纤维化的改善作用

4．1 材料和方法

4．2 结果

4．3 讨论

4．4 小结

全文总结

参考文献

文献综述 Wnt／β-catenin信号通路在肾纤维化的作用

攻读学位期间发表的论文

致谢