溴结构域包含蛋白2在小鼠脑内的表达及其对皮质神经元突起发育的影响

摘要

背景：大脑皮质神经元在机体活动中发挥多种重要的生理功能，是大脑发挥调节作用的基本结构和功能单位。大脑皮质的发育形成是一个多步骤、复杂的渐进过程，在许多因素的严谨调控下，分步骤、有次序地进行。在皮质的发育过程中，内源性因素或外源性因素会通过影响神经干细胞的增殖分化、神经元的迁移定位以及神经突起的数量、分支、形态、方向等对皮质的发育造成影响，从而改变正常机体的生理功能。因此，对大脑皮质发育各环节参与的分子机制研究尤为重要。
　　溴结构域包含蛋白2(Bromodomain containing protein2，Brd2)是溴结构域包含蛋白家族成员之一，其作为主要的表观遗传调节因子在一些临床疾病，如癌症、肥胖、2型糖尿病以及神经精神性疾病中发挥重要作用。此外，Brd2亦通过调控多种靶蛋白的转录，对细胞增殖、分化、细胞周期甚至凋亡进行调控。既往研究表明Brd2在神经系统胚胎的早期发育过程中具有丰富的表达，神经元增殖后，Brd2能够利用基因调控丰富新生神经元的细胞种类;而如果缺失Brd2，将会引起神经前体细胞的增殖变多，更严重的会导致神经管延迟闭合。这些研究表明，Brd2在神经系统的发育过程中作用明显。然而，当前关于Brd2在哺乳动物神经系统正常发育中的分布及作用机制的研究还比较匮乏，亟需开展研究。
　　目的：本文通过综合应用发育神经生物学研究方法和形态学方法，探讨Brd2在中枢神经系统中的定位分布以及其细胞化学特点，探究Brd2对皮质神经元发育的影响及其机制，为进一步阐明Brd2在大脑发育过程中的调控提供有力的研究证据。
　　方法：1.Brd2在成年小鼠大脑皮质的定位分布及细胞化学特点
　　运用荧光原位杂交技术观察了成年小鼠脑内Brd2基因的分布模式;借助荧光原位杂交技术联合免疫荧光染色技术，对Brd2阳性细胞的细胞化学特点进行了观察。
　　结果：
　　1)荧光原位杂交组织化学结果显示在成年小鼠脑内，Brd2 mRNA杂交信号在前脑主要表达于大脑皮质、尾壳核、海马、基底外侧杏仁核，在缰核、丘脑以及下丘脑等区域也有部分表达;在中脑主要表达于导水管周围灰质;在后脑及延髓主要表达于孤束核、小细胞网状核以及小脑皮质等。
　　2)荧光原位杂交联合免疫荧光标记技术结果显示，在成年小鼠大脑皮质中，Brd2mRNA阳性信号分布较广泛，主要分布于大脑皮质Ⅱ-Ⅲ层和Ⅴ-Ⅵ层，在Ⅰ层和Ⅳ层亦有少量分布。其中大多数阳性信号与神经元标志物NeuN共存，而与星形胶质细胞标志物GFAP不共存。提示在成年大脑皮质中Brd2主要表达于神经元中，可能对神经元的发育调控发挥作用。
　　3)借助Brd2 mRNA荧光原位杂交联合免疫荧光标记技术，观察了大脑皮质中Brd2阳性神经元与GABA能中间神经元及其亚类(PV，SOM，CB)的共存关系。结果显示Brd2/GABA双标记神经元约占Brd2阳性神经元的21％，约占GABA阳性神经元的68％; Brd2/PV双标记神经元约占Brd2阳性神经元的12％，约占PV阳性神经元的27％; Brd2/SOM双标记神经元约占Brd2阳性神经元的15％，约占SOM阳性神经元的92％; Brd2/SOM双标记神经元约占Brd2阳性神经元的23％，约占CB阳性神经元的72％。
　　2.下调Brd2对体外培养皮质神经元突起形态的影响
　　从体外培养皮质神经元的转染率、神经元活性以及树突分支情况角度对非病毒基因转染技术进行了对比，表明脂质体转染优于电穿孔转染。之后借助优化的脂质体转染体系，观察下调Brd2对体外培养皮质神经元形态的影响。结果如下：
　　1)电穿孔转染对神经元的存活率影响较小，而神经元存活率随着用于转染脂质体的体积增加而减少。
　　2) Sholl分析结果显示树突分支的复杂性具有距离依赖性，在20-50μm为半径的圆轨迹内存在最复杂的树枝状分支;不同转染条件显著影响树突分支，在距胞体相同距离的情况下，神经元突起与同心圆交点个数最多的实验组为4μl脂质体转染组，最少的实验组为电穿孔转染组。此外还观察到不同组别的树突总长度有显著不同。实验组中4μl脂质体转染组神经元突起总长度最长，最短实验组为电穿孔转染组。
　　3)借助3μl脂质体转染体系，针对原代培养皮质神经元给予Brd2 shRNA下调质粒，PCR结果显示下调效率约为57％。免疫荧光染色结果显示下调Brd2可以增加离体培养皮质神经元的突起总长度，提示Brd2对神经元的突起生长具有抑制作用。
　　3.体内电转下调Brd2对皮质神经元突起形态的影响
　　采用子宫内胚胎电转技术，借助Brd2 shRNA重组质粒，在体观察下调Brd2对皮质神经元突起形态的影响。结果如下：
　　1) E15电转Brd2 shRNA重组质粒分别至胎鼠感觉皮质或前额叶皮质附近，出生后3周进行灌注取材，免疫荧光结果表明电转细胞在皮质中主要分布于Ⅴ/Ⅵ层，在Ⅱ/Ⅲ层亦有分布。电转细胞在皮质各层的分布比例同对照组相比无统计学差异(P＞0.05)。提示E15下调Brd2对皮质神经元的迁移可能没有影响。
　　2) E15电转乱序质粒至胎鼠感觉皮质或前额叶皮质附近，出生后3周进行灌注取材，免疫荧光结果可见Ⅴ层中电转神经元胞体多为锥形，胞体大小、细胞形态等类似，且均发出长长的顶树突指向皮质表层。而电转Brd2 shRNA重组质粒时可见大量迂曲样短突起。这就提示，E15下调Brd2可影响皮质神经元突起的发育。但是，Brd2具体是通过什么机制来调控皮质神经元突起的发育还有待进一步实验探明。
　　结论:1) Brd2基因在成年小鼠脑内广泛表达，在成年大脑皮质中Brd2主要表达于神经元中，可能对神经元的发育调控发挥作用。
　　2)对于体外培养皮质神经元突起形态的研究来说，脂质体转染优于电穿孔转染。下调Brd2可以增加离体培养皮质神经元的突起总长度。
　　3)在体胚胎电转Brd2 shRNA重组质粒对皮质神经元的迁移可能影响不大，但可影响皮质神经元突起的发育。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

1．1 选题缘由

1．2 研究背景和意义

1．3 研究内容

1．4 研究方法

第二章 Brd2在成年小鼠脑内的分布及细胞化学特点

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 下调Brd2对体外培养皮质神经元突起形态的影响

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 体内电转下调Brd2对皮质神经元突起形态的影响

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．3 结果

4．4 讨论

4．5 小结

全文总结

参考文献

文献综述一 大脑皮质发育的分子调控机制研究进展

文献综述二 靶向基因组编辑技术在神经发育研究中的应用进展

攻读学位期间的研究成果

致谢