p75NTR在大鼠颌突外胚间充质干细胞体外矿化过程中表达变化的研究

摘要

目的:
　　牙齿缺失几乎是每个人一生当中必须面对的问题，特别是社会逐步进入人口老龄化的今天，这一问题尤为普遍，对人类健康的危害和生活质量的影响也越来越突出。目前临床上解决这一问题的主要手段是义齿，但无论是在功能还是感觉上，都无法与天然牙相比。因此需要一种与天然牙具有最为相似或者完全相同功能的修复体，无疑组织工程化牙齿是较为理想的选择，但由于牙齿发育的确切机制尚未明确，制约了组织工程化牙齿的发展进程。而模拟牙发育外胚间充质-上皮作用理论的细胞重聚技术为组织工程化牙齿发展注入新的理念，作为牙源性干细胞的始祖细胞——颅神经嵴来源的EMSCs是细胞重聚技术获得再生牙最为理想的种子细胞。但当前对颅神经嵴来源的EMSCs的体外分化命运及影响因素了解还远远不够。因此，通过探讨不同胚龄EMSCs的矿化能力，了解其体外分化命运，有助于推进组织工程牙齿的发展进程，同时为组织工程化牙齿探寻良好的种子细胞。
　　p75神经营养受体(p75 neurotrophin receptor，p75NTR)作为神经营养因子的低亲和力受体，主要表达在神经细胞的早期发育中，被认为是颅神经嵴的经典标志物，参与细胞的生存、增殖、迁移、分化和凋亡等多重生物学效应。目前，p75NTR在神经系统发育和再生中的调控作用已得到较充分阐述，但是参与神经系统以外组织（如脂肪、肝脏、肌肉、牙齿等）形态发生的研究尚处于起步阶段，特别是在牙齿发育过程中的作用鲜有报道。本课题组前期的研究已证实，颅神经嵴细胞于大鼠E11.5d迁移至颌突组织，E12.5d牙发育尚未启动。本实验在以往研究的基础上进一步通过比较p75NTR在不同胚龄大鼠颌突EMSCs体外矿化过程中的表达变化，初步探讨p75NTR在颌突EMSCs矿化过程中的作用，为揭示牙齿发育的分子生物学机制提供实验基础。
　　内容:
　　1.HE染色观察不同胚龄大鼠牙胚的形态观察
　　受孕12.5d、13.5d、15.5d和18.5d SD大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠(40mg/kg)，等待5-10min左右，行腹腔手术取出胚胎，4％多聚甲醛固定24h，包埋，按矢状面方向切片，厚度为8μ m，HE染色，显微镜下观察、拍照。
　　2.E12.5d、E13.5d、E15.5d和E18.5d SD大鼠颌突EMSCs的体外培养及鉴定
　　受孕E12.5d、13.5d、15.5d和18.5d SD大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠(40mg/kg)，等待5-10min左右，行腹腔手术，无菌条件下取出胎鼠，切取颌突，切成0.1 mm*0.1 mm*0.1mm的组织块，胰酶消化、离心，经不锈钢筛网过滤后分别加入含100ml/L胎牛血清的培养基，置于5％CO237℃孵育箱中培养。分别从细胞形态、细胞增殖能力、细胞免疫荧光、流式细胞技术检测细胞表面抗原对E12.5d、E13.5d、E15.5d、E18.5dEMSCs进行生物学鉴定。
　　3.E12.5d、E13.5d、E15.5d和18.5d EMSCs体外矿化诱导
　　分别对E12.5d、13.5d、15.5d和18.5d颌突EMSCs进行矿化诱导，于诱导0d、7d、14d、21d后分别观察细胞形态、ALP活性、矿化能力、矿化相关基因蛋白以及p75NTR的表达变化。
　　结果:
　　1.E12.5d大鼠牙胚处于牙板形成期，口腔上皮向组织内部生长形成的一种上皮性结构;E13.5 d进入牙胚发育的蕾状期，此时牙胚的牙板末端膨大，上皮细胞增生形成卵圆形或圆形的上皮芽，形似花蕾。E15.5 d大鼠牙胚的上皮芽继续生长、增大，长入上皮基底部向内凹陷形似帽子，覆盖在外胚间叶细胞聚集区，称为帽状期，成釉器分为三层细胞:即外釉上皮层、星网状层和内釉上皮层。其中成釉器下方的细胞聚集区称为牙乳头，形成牙本质和牙髓，包绕成釉器和牙乳头的外胚间叶细胞称为牙囊，形成牙支持组织。E18.5 d大鼠牙胚发育进入钟状期，上皮凹陷加深，周缘继续生长，形似吊钟，此时成釉器进入成熟期，分为4层细胞即外釉上皮层、星网状层、中间层和内釉上皮层，内釉上皮与外釉上皮相连处称为颈环。
　　2.(1)体外分离、培养的E12.5d、E13.5d、E15.5d、E18.5dEMSCs均为长梭型的成纤维样细胞，胞体丰满，细胞增殖能力强。(2)流式细胞检测:E12.5dEMSCs的CD14、CD29、CD90、CD146、CD166、p75NTR表达率分别为:92.93％、98.39％、95.49％、92.86％、91.44％、22.53％, E13.5dEMSCs的CD14、CD29、CD90、CD146、CD166、p75NTR表达率分别为:97.01％、96.64％、97.70％、98.26％、97.15％、82.42％,E15.5dEMSCs的CD14、CD29、CD90、CD146、CD166、p75NTR表达率分别为:95.65％、98.50％、98.49％、97.90％、99.51％、85.09％, E18.5dEMSCs的CD14、CD29、CD90、CD146、CD166、p75NTR表达率分别为:95.79％、96.97％、91.28％、97.92％、96.83％、81.43％，CD45在E12.5d、E13.5d、E15.5d和E18.5dEMSCs表达率分别为:5.78％、5.24％、8.34％、8.51％。E12.5d、E13.5d、E15.5d和E18.5d颌突EMSCs均阳性表达CD14、CD29、CD90、CD146、CD166、p75NTR，阴性表达CD45。
　　3.(1)碱性磷酸酶染色结果:矿化诱导7d后，各实验组染色较对照组深，E18.5dEMSCs实验组染色最深。(2)茜素红染色结果:矿化诱导21天后，各组均有矿化结节形成，其结果与ALP染色结果一致，即E18.5dEMSCs实验组矿化结节形成量最多。(3) RT-PCR结果:矿化诱导7天后，各组提取总RNA，逆转录后进行PCR反应，各实验组ALP表达水平明显高于对照组，其中E18.5dEMSCs表达较高(P＜0.05);矿化诱导14d后，各实验组矿化相关基因Runx2、ColI以及p75NTR mRNA表达高于对照组，在E18.5dEMSCs实验组表达较高(P＜0.05);对照组p75NTR的表达未见明显变化。(4) Western blot结果:矿化诱导14d，矿化相关蛋白Runx2、ColI表达量在E18.5dEMSCs实验组较高，蛋白灰度值检测其差异有统计学意义(P＜0.05);矿化前期各组p75NTR蛋白未见明显变化，而21d后各实验组明显高于对照组，蛋白灰度值检测其差异有统计学意义(P＜0.05)，各对照组间未见明显变化。
　　结论:
　　通过不同胚龄颌突外胚间充质干细胞的培养、生物学鉴定和体外矿化诱导，以及对矿化相关基因蛋白的检测，发现E12.5d、E13.5d、E15.5d和E18.5dEMSCs均为颅神经嵴源性的间充质干细胞，其中E18.5dEMSCs增殖能力和矿化能力强，这说明E18.5dEMSCs是未来研究牙组织工程较为理想的种子细胞;流式检测发现p75NTR在E13.5d表达显著升高，并保持高表达，以及p75NTR在矿化诱导后表达明显升高，推测p75NTR可能参与成牙初期牙齿的发育。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 不同胚龄大鼠牙胚形态观察

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 不同胚龄颔突外胚间充质干细胞的培养及生物学鉴定

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

第四章 不同胚龄颌突外胚间充质干细胞体外矿化能力的研究

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

全文小结

参考文献

文献综述 p75神经营养受体的研究进展

硕士在读期间发表文章

致谢