金黄色葡萄球菌MntC亚单位疫苗制备及其免疫优势表位鉴定与功能研究

摘要

目的:
　　本研究拟运用基因工程技术克隆表达MntC抗原蛋白，将高度纯化的MntC抗原与不同免疫佐剂配制成MntC亚单位疫苗，经金葡菌感染动物模型免疫攻毒保护试验，确定其免疫保护性。同时，合成重叠18肽，采用氨基酸步移技术，高通量筛选MntC抗原优势保护性B细胞表位，将获得的优势表位与蛋白钥孔戚血蓝素(Keyhole limpethemocyanin，KLH)偶联，制备成表位多肽疫苗，评价其免疫保护效果，鉴定MntC免疫保护性优势抗原B细胞表位功能，探讨优势抗原B细胞表位免疫应答机制，为金葡菌疫苗抗原组分筛选提供免疫学依据。
　　方法:
　　第一部分:金葡菌MntC基因工程疫苗菌株构建及其免疫保护功能研究
　　1.为制备重组MntC蛋白，运用生物信息学方法检索金葡菌MntC蛋白的基因序列及氨基酸信息，利用基因工程技术构建含有MntC全长蛋白的原核表达质粒，通过pGEX-6p-2载体系统在大肠杆菌BL21中表达重组MntC蛋白，经SDS-PAGE鉴定蛋白的分子量和纯度。使用MMC离子交换层析法纯化蛋白，使其纯度大于95％，通过Q-HP填料去除内毒素，用BCA法检测纯化后蛋白浓度。
　　2.为评价MntC疫苗对金葡菌感染的免疫保护效果，分别使用弗氏佐剂(CFA/IFA)和铝(Alum)佐剂制备MntC蛋白疫苗，于0、14、21天免疫BALB/c小鼠，末次免疫后14天，选用金葡菌国际标准株MRSA252攻毒，统计攻毒后14天内不同实验组小鼠的生存数量，并按照以下公式计算疫苗免疫保护率:疫苗免疫保护率％=（疫苗试验组小鼠生存率％-佐剂对照组生存率％）/疫苗试验组小鼠生存率％。
　　3.为评价MntC疫苗对不同地区及标本来源金葡菌菌株感染的免疫保护效果，选取金葡菌国际标准株WHO2及3株分别来自我国北京、广州、重庆地区临床分离株进行攻毒，统计攻毒后14天内不同实验组小鼠的生存数量，并按照以下公式计算疫苗免疫保护率:疫苗免疫保护率％=（对照组感染率-试验疫苗组感染率）/对照组感染率×100％。
　　4.为评价疫苗免疫后小鼠的体液和细胞免疫应答水平，分别收集疫苗免疫后的小鼠血清，用ELISA法检测小鼠IgG、IgG1和IgG2a的抗体表达水平;手术摘取疫苗免疫后的小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，与MntC抗原共培养，收集脾细胞培养上清，检测脾细胞分泌的IFN-γ、IL-5、IL-17A水平。
　　第二部分:金葡菌MntC蛋白B细胞优势表位鉴定及表位疫苗的免疫保护功能研究
　　1.免后阳性血清制备:采用弗氏佐剂(CFA/IFA)制备MntC疫苗，于0、14、21天免疫接种10只BALB/c小鼠，末次免疫后7天采集分离血清，标记对应小鼠序号后，-80℃保存，备用于优势表位鉴定试验;
　　免后感染阳性血清制各:采用弗氏佐剂(CFA/IFA)制备MntC疫苗，于0、14、21天免疫接种10只BALB/c小鼠，末次免疫后14天的小鼠经亚致死剂量(8.4×108CFU)金葡菌株MRSA252攻毒，感染后3天采集分离血清，标记对应小鼠序号后，-80℃保存，备用于优势表位鉴定试验;
　　阴性对照血清制备:采集10只正常BALB/c小鼠血清，标记对应小鼠序号后，-80℃保存，备用于优势表位鉴定试验;
　　2.为系统分析金葡菌MntC抗原的线性B细胞免疫优势表位肽，合成覆盖MntC全长的46条重叠18肽，以无关肽段GST和无关蛋白BSA作为阴性对照，以MntC蛋白作为阳性对照，分别作为捕获抗原包被于ELISA反应板孔，然后分别加入上述3种血清，根据各肽段与抗血清反应结合的能力，鉴定出MntC抗原的优势免疫表位。
　　3.为明确优势表位在多种金葡菌株中的序列保守性，通过Uniprot蛋白数据库对17种不同来源金葡菌株中MntC的氨基酸序列进行同源性比对。同时用PyMOL1.1软件定位鉴定优势表位在全蛋白结构中的位置。
　　4.为评价MntC优势表位肽免疫保护能力，分别将筛选到的优势表位肽与KLH偶联，再与等体积CFA/IFA进行乳化混合，制备成多个多肽表位疫苗。同时将制备好的多个表位疫苗以物理方式混合，制成多表位联合疫苗。以MntC全蛋白为阳性对照、以KLH蛋白作为阴性对照，0、14、21天免疫BALB/c小鼠，末次免疫后的14天进行MRSA252菌株的致死剂量攻毒，分析感染后14天内小鼠生存率和免疫保护率。
　　5.收集分离单一表位疫苗及多表位联合疫苗免疫后小鼠血清，使用ELISA法检测抗血清的IgG抗体及其亚型IgG1、IgG2a、IgG2b的水平。
　　6.参考《中国药典》（2015年版）进行抗体介导的体外调理吞噬试验，计算各试验组抗血清杀菌率。
　　结果:
　　第一部分:金葡菌MntC基因工程疫苗菌株构建及其免疫保护功能研究结果
　　1.成功制备出重组MntC蛋白;经鉴定，MntC蛋白的分子量在33KD左右;经多步纯化MntC纯度为98％，符合后期疫苗抗原的质量要求;BCA法检测蛋白浓度为1.6 mg/mL。
　　2.组氨酸缓冲液对照组、弗氏佐剂对照组、铝佐剂对照组、MntC弗氏佐剂疫苗试验组及MntC铝佐剂疫苗试验组的生存率分别为0％(0/0)、0％(0/9)、0％(0/9)、56％(5/9)、44％(4/9)。MntC弗氏佐剂疫苗试验组及MntC铝佐剂疫苗试验组的免疫保护率分别为56％、44％。结果表明:当佐剂与MntC形成疫苗时，可产生良好的免疫保护效果。由此提示，MntC具有良好的免疫原性。
　　3.4种不同来源金葡菌株攻毒后疫苗试验组的保护率分别为25％、38％、50％和56％，各试验组保护率结果与对照组相比较具有显著性统计学差异(P＜0.05)，但是，不同攻毒菌株试验组之间保护率结果具有不同差异。由此提示，MntC铝佐剂疫苗对不同来源的金葡菌株具有广泛的免疫保护性。
　　4.MntC弗氏佐剂疫苗组激发的的IgG和IgG1抗体水平显著高于MntC铝佐剂疫苗组抗体水平(P＜0.01); IgG2a抗体水平在两种佐剂疫苗组之间无显著性统计学差异(P＞0.05)。
　　5.疫苗免疫后，各组小鼠脾细胞分泌IL-5的表达水平无显著性统计学差异(P＞0.05)，但是MntC弗氏佐剂疫苗组小鼠脾细胞分泌的IFN-γ和IL-17A的水平显著高于MntC铝佐剂疫苗组细胞因子水平(P＜0.01)。
　　第二部分:金葡菌MntC蛋白B细胞优势表位鉴定及表位疫苗的免疫保护功能研究
　　1.氨基酸步移法的ELISA检测结果发现，在MntC全长309个氨基酸中，有3个B细胞免疫优势抗原表位，分别为:MntC113-136、MntC209-232和MntC263-286。
　　2.所鉴定出的MntC113-136、 MntC209-232和MntC263-286三个优势表位肽在免疫后血清中的IgG抗体效价为1∶1200，在免疫后感染血清中的IgG抗体效价为1∶600，而其它非优势表位肽的抗体应答水平均低于1∶100，两者比较，具有显著性统计学差异(P＜0.01)。
　　3.同源性分析显示，3个优势表位的氨基酸序列在17株来源不同金葡菌株中的一致性为100％，具有高度保守性。定位于MntC三维晶体结构中抗原表面，且均为显性免疫原性刺激区。
　　4.在弗氏佐剂辅助下，免疫优势表位多肽联合疫苗及MntC疫苗的免疫保护率分别为78％和67％，显著高于单独表位疫苗组和佐剂及缓冲液对照组(P＜0.01)。
　　5.免疫优势表位多肽联合疫苗组和MntC全蛋白疫苗组均激发了较高的IgG、IgG1和IgG2b抗体水平，呈现Th2偏向的体液免疫应答，其血清总抗体IgG表达效价可高达1∶1024000;相对于表位疫苗组，MntC全蛋白疫苗组更倾向于引起Th1细胞免疫应答的IgG2a抗体高表达。
　　6.免疫优势表位多肽联合疫苗及MntC疫苗抗血清，在体外对MRSA252杀伤率均可达到85％以上，并且经过1∶3的稀释后，该抗血清体外调理吞噬金葡菌的能力仍可维持在50％以上，显著高于单表位疫苗组和佐剂、缓冲液对照组(P＜0.01)。
　　结论:
　　通过基因工程技术制备了MntC亚单位疫苗，经过小鼠金葡菌全身感染致死模型免疫攻毒保护试验，表明MntC疫苗对于不同来源的金葡菌株具有良好的免疫保护效果，MntC有望成为金葡菌疫苗的候选抗原组分。免疫应答检测结果显示体液免疫发挥了主导作用。通过合成46条18-肽，运用氨基酸步移法首次鉴定发现了MntC中3个免疫优势抗原表位，分别是MntC113-136、MntC209-232和MntC263-286。这些表位在不同的金葡菌株中都具有高度保守性，定位于MntC蛋白三维晶体结构的表面，处于显性免疫原性刺激区。分别将3个优势多肽表位与KLH偶联，制备成免疫优势表位多肽联合疫苗，激发了较高的IgG、IgG1和IgG2b抗体水平，呈现Th2偏向的体液免疫应答，血清总IgG表达效价达1∶1024000，免疫保护率为78％，显著高于单独表位疫苗组(P＜0.01);特异性抗体具有高效体外调理吞噬杀伤金葡菌的功能。阐明了MntC抗原免疫保护应答新机制，为金葡菌疫苗的研制提供了新的实验证据与新思路。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

1．1 研究背景

1．2 研究依据

1．3 研究内容

第二章 金葡菌MntC基因工程疫苗菌株构建及其免疫保护功能研究

2．1 材料与方法

2．2 实验结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 金葡菌MntC蛋白B细胞优势表位鉴定及表位疫苗的免疫保护功能研究

3．1 材料与方法

3．2 实验结果

3．3 讨论

3．4 小结

全文结论

参考文献

文献综述 金黄色葡萄球菌疫苗与免疫治疗

攻读学位期间发表的论文

致谢