类鼻疽菌抑制巨噬细胞自噬逃逸清除的分子机制和流行病学研究

摘要

目的：
　　类鼻疽伯克霍尔德菌（简称类鼻疽菌）属兼性胞内菌，作为人类鼻疽病的病原体，是一种环境寄生的机会致病菌，广泛分布于东南亚和澳洲北部。我国海南、广东和广西等地是类鼻疽的疫源地。2016年的第1期Nature Mirobiology杂志对全球类鼻疽菌流行扩散形势和感染风险进行预测分析，估算2015年在全球范围内类鼻疽感染病例超过16万人，死亡人数约9万人。鉴于类鼻疽的严重致病性，美国CDC早在2006年就将类鼻疽菌列为Ⅰ类病原体严加防范。
　　90年代，我国学者宋阳等已经报道过类鼻疽菌在海南的地理分布，当地疾控中心也曾进行过类鼻疽菌的环境监测，但可查资料仍然很少，类鼻疽的扩散之势可能早已远超我们估计。多位点序列分型(MLST)是一种基于核酸序列（七个管家基因）测定的细菌分型方法，也可用于分析不同ST型之间的系统发育关系以及与疾病的联系。早在2003年MLST就被应用到类鼻疽菌的分子流行病学研究中，它操作简单，分辨力高，更便于国际同行进行数据共享。目前，我国还没有类鼻疽菌MLST的相关文章报道，分析我国类鼻疽的流行形势和类鼻疽菌的变化趋势显得日益重要。因此，我们随机选取了跨越11年的102株临床类鼻疽菌株进行了MLST分型，借此分析发现近年我国类鼻疽菌的变异规律和扩散趋势，进一步完善我国类鼻疽菌株基因信息数据库，为我国类鼻疽的溯源和预警提供参考。
　　2012年Wiersinga WJ在新英格兰杂志报道了类鼻疽的全球流行趋势，估算其发病率达50/100000，引起了国际同行对于类鼻疽研究的高度关注。在中国，类鼻疽的研究并未引起足够的重视有多方面的原因，其中，首要的原因是诊断困难，导致类鼻疽的漏诊率极高。其次是类鼻疽的临床表现多样缺乏特征，易误诊为其他感染性疾病。即使在海南当地，很多医生仍然对类鼻疽比较陌生，更不用说内地的医疗工作者了。为此，我们基于海南当地三所最大医院的数据库，收集了跨越11年共计170例类鼻疽病例的临床资料，汇总分析了我国类鼻疽感染风险、流行趋势、地理分布、季节分布和临床特征，为我国类鼻疽的临床诊断和调查分析提供借鉴和参考。
　　临床类鼻疽治疗中最难控制的问题即是感染的慢性化和复发。即使在规范抗生素用药情况下，复发率仍达到20％。已有文献报道，类鼻疽菌可以侵入几乎所有的宿主细胞，在其中寄居和生存，并导致宿主细胞融合实现病原菌自身的增殖和扩散。而这可能就是导致类鼻疽感染慢性化和易复发的重要原因。自噬是清除胞内病原体的重要途径之一，自噬体捕获病原体，通过与溶酶体结合，形成成熟的自噬溶酶体降解细菌从而达到抵抗胞内菌入侵和感染的目的。但是有些病原体已经进化出能够抵抗或者逃避自噬清除的机制，而类鼻疽与宿主自噬之间的关系以及它是如何抵制宿主细胞自噬清除的机制还有待进一步阐明。我们前期的研究已经发现类鼻疽可以通过诱导某些特殊miRNA来抑制人肺上皮细胞的自噬水平，抑制自噬体的形成从而实现在胞内的生存和增殖。基于对类鼻疽菌感染的小鼠巨噬细胞RAW264.7的基因芯片分析，我们发现，类鼻疽菌抑制小鼠细胞的自噬消化并不是通过抑制自噬体形成，而是通过影响自噬体与溶酶体的融合、抑制自噬溶酶体的成熟来实现的，而且这一抑制过程也是由类鼻疽菌诱导的特异性miRNA所介导。这项研究表明，自噬，尤其是完整的自噬对于宿主细胞对抗胞内菌感染是非常重要的。同时，前期研究结果也提示我们，微生物诱导的miRNA在影响宿主细胞信号通路中具有重要作用，可能与许多的微生物感染进程紧密相关，也暗示我们利用小RNA干扰策略或许能够给对抗微生物感染提供不一样的治疗思路。
　　方法:
　　1.中国海南类鼻疽-回顾性分析
　　1.1 基于海南当地三所最大医院的数据库，收集跨越11年共计170例类鼻疽病例的临床资料;
　　1.2 所有病例均需临床和实验室确认类鼻疽诊断;
　　1.3汇总分析我国类鼻疽感染风险、流行趋势、地理分布、季节分布和临床特征。
　　2.类鼻疽菌的MLST分析
　　2.1 对102株临床分离的类鼻疽菌株首先进行生化与16S rDNA PCR鉴定;
　　2.2 对类鼻疽菌ace，ghmD, gltB, lipA，lepA，nark, ndh七个管家基因进行扩增和测序分析;
　　2.3 在线分析测序结果，确定ST型，上传数据，在线对本次研究菌株序列或者综合类鼻疽菌MLST数据库序列进行e-BURST分析，UPGMA方法构建系统进化树对收集的菌株进行溯源分析等;
　　2.4 运用MLST及16S rDNA分型等方法对镇江1例输入性类鼻疽病例进行实验室确诊和溯源分析。
　　3.类鼻疽菌抑制巨噬细胞自噬研究
　　3.1 类鼻疽菌感染RAW细胞模型和不同感染时相条件下的表达谱芯片分析;
　　3.2 小RNA干扰或者真核过表达，用于分析自噬信号通路关键蛋白在类鼻疽的胞内增殖作用;
　　3.3 激光共聚焦、高分辨显微镜和透射电镜用于观察胞内LC3B转化，细胞融合，胞内菌生存情况，自噬体以及自噬溶酶体的形成;
　　3.4 CFU平板计数用于定量细胞内类鼻疽菌的增殖情况;
　　3.5 qRT-PCR用于定量mRNA水平，而western blot用于反映自噬分子蛋白水平;
　　3.6 荧光素酶实验用于miR-146a靶基因鉴定试验;
　　3.7 数据分析:Logstic regression用于危险因素相关性分析;e-BURST用于MLST分型数据分析;CLC genomics workbench用于序列分析和引物设计;GraphPad Prism5.0统计作图;ZEN2012分析共聚焦数据;Bio-Rad CFX Manager3.0用于定量PCR结果分析;Adobe Illustrator CS3进行图片整合;Student's t检验用于检测两样本之间差异，*P＜0.05有统计学意义。
　　结果:
　　1.中国海南类鼻疽临床回顾性研究
　　1.1 中国类鼻疽病例呈现增长态势;
　　1.2 中国类鼻疽临床表现有自身特点，主要以肺炎和败血症为主，脏器脓肿、儿童感染和颅内感染较少见;
　　1.3 类鼻疽的感染与机体免疫因素相关，相当一部分呈现慢性感染;
　　2.MLST分析
　　2.1 102株类鼻疽菌ST型别多达41种，发现8种新的ST型，均已提交至数据库;
　　2.2 ST-46，ST-50，ST-55，ST-58，ST-70和ST-1095是102株类鼻疽菌中的主要ST型，用于MLST分型的管家基因中gmhD表现出更多的变异特征，系统发生分析发现，中国与泰国在类鼻疽菌的进化上关系紧密，与其它疫区也可能存在交流播散;
　　2.3 准确鉴定了2014年江苏输入性类鼻疽病例并成功指导其处置。
　　3.类鼻疽菌诱导的miR-146a抑制小鼠巨噬细胞自噬有利于其胞内的生存
　　3.1 类鼻疽菌可以诱导巨噬细胞自噬体的形成但是却能与之共处;
　　3.2 自噬体只能在类鼻疽菌感染小鼠巨噬细胞初期捕获和限制类鼻疽菌的生存和增殖;
　　3.3 类鼻疽菌虽然促进了自噬体的生存，但是却抑制了自噬流;
　　3.4 基于芯片检测和溶酶体信号通路表达谱分析，Lipa蛋白水平受抑可能是类鼻疽菌抑制宿主细胞自噬的效应靶点，而前者是细胞自噬溶酶体成熟的关键蛋白;
　　3.5 同时发现，类鼻疽菌感染后，伴随着Lipa蛋白水平受抑，miR-146a呈现上调;
　　3.6 生物信息学在线分析Lipa可能是miR-146a的靶蛋白，并经靶基因鉴定实验证实;
　　3.7 类鼻疽菌可借助miR-146a-Lipa信号通路抑制小鼠巨噬细胞自噬，从而促进其在宿主细胞中的生存和增殖。
　　结论:
　　本研究，一方面增强了我们对于类鼻疽的临床认识，了解了当前类鼻疽的流行形势和变异特点，完善了我国类鼻疽菌株基因信息数据库，可为临床医生尤其是疫区以外的医务工作者对类鼻疽的诊断提供借鉴和参考，同时为我国类鼻疽的溯源和预警提供指导;另一方面，通过深入探讨类鼻疽菌的自噬逃逸机制，对类鼻疽的临床棘手问题（感染慢性化和复发）提供了机理解释，提示我们微生物诱导的miRNA在影响宿主细胞信号通路中的重要作用，为临床对抗类鼻疽菌感染治疗提供了新的思路。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 类鼻疽菌分子流行病学研究

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 类鼻疽菌抑制巨噬细胞自噬逃逸清除的分子机制研究

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

全文结论

参考文献

文献综述

研究生期间发表的与课题相关的论文及获奖情况

致谢