基于双室培养系统构建含天然钙化层仿生组织工程骨软骨

摘要

本文从以下几部分进行论述：
　　第一部分 含天然钙化软骨层仿生组织工程骨软骨支架的制备及检测
　　目的：
　　本部分研究中，我们钻取正常猪膝关节股骨髁负重面骨软骨柱，削去骨柱透明软骨部分。切下的透明软骨用于Ⅱ型胶原蛋白提取，而含钙化软骨层的软骨下骨柱行脱细胞处理。然后将提取的Ⅱ型胶原蛋白水凝胶接种于钙化层之上，经过冻干及交联等步骤，获得含天然钙化层的仿生骨软骨支架，并对支架相关特性进行检测。
　　方法：
　　1.含天然钙化软骨层骨柱的制备及检测
　　(1)钻取直径为12 mm的含有天然钙化软骨层结构的骨柱，削去透明软骨层;
　　(2)Triton X-100脱去骨柱中的细胞;
　　(3)HE染色及DAPI染色观察骨柱中细胞是否洗脱干净。
　　2.Ⅱ型胶原蛋白水凝胶的制备
　　(1)获取透明软骨粉;
　　(2)胃蛋白酶消化，盐析及透析。
　　3.骨软骨支架的制备及检测
　　(1)三维打印构建骨软骨支架制备模具;
　　(2)通过模具在脱细胞骨支架上灌注Ⅱ型胶原蛋白水凝胶，再通过冻干、交联等步骤制备骨软骨支架;
　　(3)检测支架孔隙率、孔径、细胞毒性及结构特征。
　　结果：
　　构建的骨软骨支架呈深蓝色，细胞洗脱彻底，Ⅱ型胶原蛋白海绵支架平均孔隙率为(96.1±3.8)％，扫描电镜下测其孔径平均大小为(102.3±35.3)μm，脱细胞软骨下骨支架的平均孔隙率为(73.5±2.6)％，其平均孔径大小为(470.2±158.8)μm，呈多孔网状结构，孔隙结构良好，孔孔相通。支架浸提液对细胞生长无明显影响。
　　第二部分 含天然钙化软骨层仿生支架双室培养系统的构建
　　目的：
　　本部分研究中，为了给软骨层及软骨下骨层提供独立的培养微环境，我们设计了基于钙化软骨层的双室培养系统，利用钙化软骨层的隔离带作用，为软骨腔及软骨下骨腔分别提供成软骨及成骨培养基。在成软骨及成骨的环境中，诱导间充质干细胞分别向软骨细胞及成骨细胞的方向分化。这种双室培养系统更加符合骨软骨组织的生理特征，因此可能构建出更加仿生的骨软骨缺损修复材料。
　　方法：
　　1.双室培养装置的构建
　　(1)运用计算机辅助设计技术设计双室培养系统的计算机三维模型;
　　(2)运用三维打印技术制备双室培养系统各部件;
　　(3)组装双室培养系统，并进行密闭性测试，Co60辐照灭菌。
　　2.人羊膜间充质干细胞培养
　　Ⅰ型胶原酶消化法获取人羊膜间充质干细胞，差速消化法进行纯化。
　　3.人羊膜间充质干细胞复合支架共培养
　　(1)CFDA SE及DiI标记人羊膜间充质干细胞;
　　(2)细胞悬液接种法及凝胶接种法接种CFDA SE标记的细胞于胶原层，DiI标记的细胞于软骨下骨层，并进行双室培养;
　　(3)通过病理切片、荧光定量PCR、支架总DNA含量检测等手段，检测支架中细胞粘附、生长、增殖、分布及分化情况。
　　结果：
　　双室培养7天后，荧光显微镜下可观察到胶原层CFDA SE标记的绿色荧光细胞，软骨下骨层DiI标记的红色荧光细胞，绿色荧光细胞与红色荧光细胞分别位于钙化软骨层两边，无跨钙化层细胞迁移现象。荧光定量PCR检测胶原层内种子细胞的成软骨标志物随培养时间延长而逐渐增加，软骨下骨层内种子细胞的成骨标志物随培养时间延长而逐渐增加。支架中种子细胞总DNA含量随着培养时间的延长而逐渐增加，因此表明随着双室培养时间的延长，支架内种子细胞的数量逐渐增加。
　　第三部分 骨软骨支架动物实验
　　目的：
　　在前面的研究基础上，为了进一步验证该含天然钙化层仿生骨软骨支架对关节骨软骨损伤的修复效果。在本部分研究中我们选择贵州小香猪为实验动物，通过手术方法行膝关节股骨髁负重面骨软骨缺损造模。植入经双室培养的含天然钙化层的仿生骨软骨支架，观察其修复效果，并与空白对照及无天然钙化层仿生骨软骨支架的修复效果进行对比。
　　方法：
　　1.含天然钙化层仿生骨软骨支架双室培养
　　(1)Percoll密度梯度离心法获取猪BMSCs;
　　(2)复合支架进行双室培养。
　　2.骨软骨缺损造模及修复
　　(1)30头贵州小香猪随机分为3组，每组20膝，共60膝;
　　(2)造模，A组为空白对照组（单纯骨软骨缺损）;B组为不含钙化层骨软骨支架修复组;C组为含天然钙化软骨层骨软骨支架修复组;
　　3.修复效果评估
　　体视显微镜观察，核磁共振检查，HE染色，固绿—番红O染色，天狼星红染色及O'Driscoll组织学评分评估骨软骨缺损修复效果。
　　结果：
　　与空白对照及不含钙化层骨软骨支架相比，含天然钙化软骨层骨软骨支架在修复骨软骨缺损中具有良好的修复效果。含天然钙化软骨层骨软骨支架修复组中软骨下骨层修复组织与宿主组织无明显差异，可见完整的钙化软骨层结构。但软骨缺损部位仍有部分凹陷，修复组织表面并未与关节表面平齐。
　　结论:
　　通过低温冻干及京尼平交联技术，利用含天然钙化软骨层脱细胞骨基质及Ⅱ型胶原蛋白水凝胶可构建出含完整钙化层结构的三层仿生骨软骨支架，该支架结构良好，无明显细胞毒性。其钙化软骨层具有生理性隔离带作用，利用其生理性隔离带作用，我们构建的双室培养系统能为软骨层及软骨下骨层提供独立的生长微环境。种子细胞在含天然钙化软骨层骨软骨支架中生长良好，在诱导分化培养基的作用下，软骨层及软骨下骨层中的间充质干细胞可分别向成软骨及成骨方向分化，且随着培养时间的延长，支架内种子细胞含量逐渐增加。在骨软骨缺损修复实验中，与空白对照及不含钙化层骨软骨支架相比，含天然钙化软骨层的骨软骨支架在修复骨软骨缺损中具有良好的修复效果，其修复组织结构及成分与正常骨软骨组织类似。

目录

声明

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摘要

第一章 前言

第二章 含天然钙化层仿生组织工程骨软骨支架的制备及检测

2．1 含天然钙化软骨层脱细胞骨支架的制备

2．1．1 材料

2．1．2 实验方法

2．1．3 结果

2．2 Ⅱ型胶原蛋白水凝胶的制备

2．2．1 材料

2．2．2 实验方法

2．3 骨软骨支架的制备及检测

2．3．1 材料

2．3．2 实验方法

2．3．3 结果

2．4 讨论

第三章 含天然钙化软骨层仿生支架双室培养系统的构建

3．1 双室培养装置的构建

3．1．1 材料

3．1．2 实验方法

3．2 人羊膜间充质干细胞培养

3．2．1 材料

3．2．2 实验方法

3．3 人羊膜间充质干细胞复合支架培养

3．3．1 材料

3．3．2 实验方法

3．3．3 结果

3．4 讨论

第四章 含天然钙化层仿生组织工程骨软骨动物实验

4．1 材料

4．2 实验方法

4．3 结果

4．4 讨论

全文结论

参考文献

文献综述关节骨软骨损伤治疗策略

博士在读期间研究成果

致谢