颅内T淋巴细胞在脑出血后的变化规律及姜黄素的干预作用

摘要

脑出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)严重威胁人类的健康，具有高发病率和高死亡率的特点。为了提高ICH患者的临床疗效，重点在于更好地了解ICH后导致继发性脑损伤的机制。
　　健康的大脑拥有完整的血脑屏障(Blood-brain barrier，BBB)，T淋巴细胞几乎不能迁移入脑实质;ICH发生后，白细胞等外周免疫细胞可以大量进入脑实质，聚集在血肿的周围，产生作用。在哺乳动物的适应性免疫反应中，T淋巴细胞对抗病原菌入侵中也起着核心的作用。而且越来越多的证据表明免疫炎症反应在ICH后的继发性脑损伤中起着重要的作用。各种免疫活性成分如促炎细胞因子、补体、中性粒细胞的浸润和小胶质细胞的激活与脑出血后的继发性损伤有关。在实验性ICH中，脑内白细胞包括中性粒细胞的浸润引起的先天性免疫反应已被证实。虽然不同的淋巴细胞亚群在脑缺血中强大的保护或损害作用已被阐明，但ICH中发生后颅内浸润的T淋巴细胞很少被关注。
　　姜黄素已被发现可以通过BBB并在脑组织中保持较高的生物活性，它能有效的保护ICH后的BBB损伤，本课题组先前研究发现姜黄素能够抑制脊髓损伤后的胶质瘢痕形成和脑外伤的炎症反应;同时也有研究表明它能抑制由不同的有丝分裂如ConA诱导的淋巴细胞增殖和差异性调节CD4+辅助性T淋巴细胞的细胞应答作用。因此，本研究的目的是了解ICH后脑内浸润T淋巴细胞的变化规律和证实BBB的破坏可以促进外周T淋巴细胞迁移入脑内。此外，我们采用小鼠自体血ICH模型探讨姜黄素治疗能否减少脑浸润T淋巴细胞的数量，从而改善神经功能，进而从某种程度上改善神经炎症。
　　一、脑出血后脑内浸润T淋巴细胞随时间的变化
　　目的:了解脑出血后的T淋巴细胞浸润的时间变化规律和探讨BBB的破坏和T淋巴细胞浸润的关系。
　　方法:C57小鼠自体血注射制作脑出血模型。在ICH后的0、1、3、5、7、14天，挑选右侧大脑半球（出血侧），运用特异的T淋巴细胞标志物(CD45，CD11b，CD3，CD4，CD8)，进行流式细胞技术检测。BBB的分子机制紧密连接蛋白(claudin5、ZO-1、Occludin)和基质金属蛋白酶9(MMP9)的蛋白表达运用运用Western blot进行测定，同时claudin5采用免疫荧光技术检测。血脑屏障的通透性采用伊文思蓝染料渗透分析。
　　结果:1、脑内T淋巴细胞浸润在ICH后的第3天大量聚集在血肿周围，第5天达到高峰;同时伊文思蓝的通透和紧密连接蛋白的表达也有相似的结果。
　　2、在ICH后的第5天，同组小鼠的出血侧大脑的T淋巴细胞和MMP9的表达明显高于未出血侧。
　　结论:结果表明，脑浸润T淋巴细胞与ICH的发生拥有时间依赖性，ICH发生后，T淋巴细胞的浸润在损伤侧的大脑阳性表达较明显，且与BBB的破坏有关系。
　　二、姜黄素可降低脑出血后脑内T淋巴细胞的浸润
　　目的:探讨姜黄素是否能够降低实验性小鼠脑出血颅内T淋巴细胞的浸润。
　　方法:小鼠随机分为三组;对照组（sham组），脑出血+溶剂干预组(ICH+vehicle)，脑出血+姜黄素治疗组(ICH+Cur)。姜黄素溶于DMSO中，100mg/kg腹腔注射。对照组和脑出血+溶剂干预组注射相同体积的DMSO。用流式细胞仪检测出血侧颅内淋巴细胞的亚型及数量。免疫荧光技术检测T淋巴细胞和VCAM-1的表达。在脑出血72h后，神经功能测评采用28分神经功能评分、转角试验和前肢放置试验。脑含水量用湿/干法进行检测。VCAM-1、IFN-γ和IL-17在脑内得蛋白表达采用Western blot检测。脑内血肿大小采用MRI测定。在脑出血后的第5天，BBB的分子机制紧密连接蛋白(claudin5、ZO-1、Occludin)和基质金属蛋白酶9(MMP9)的蛋白表达运用运用Western blot进行测定。血脑屏障的通透性采用伊文思蓝染料渗透和荧光进行分析。
　　结果:1、在ICH后72小时，姜黄素治疗可明显改善神经功能的缺损和降低脑水肿。
　　2、姜黄素可减少血肿周围的T淋巴细胞的聚集，同时流式细胞仪检测发现姜黄素治疗组也能明显的减少颅内浸润T淋巴细胞的数量
　　3、Western blot分析和免疫组织化学染色表明姜黄素治疗可以显著降低血管上VCAM-1的表达，同时也减少了颅内IFN-γ和IL-17的表达。
　　4.在ICH后的第5天，姜黄素能够有效地保护BBB，并同时减少颅内T淋巴细胞的浸润。
　　结论:本部分研究结果表明，姜黄素治疗后可减轻ICH导致的脑组织炎症和脑水肿，至少在一定程度上与颅内T淋巴细胞的浸润有关系;T淋巴细胞的浸润与大脑的VCAM-1和BBB的破坏有着一定的联系。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 T淋巴细胞在脑出血后浸润脑组织的变化规律

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 姜黄素可以减少脑出血后T淋巴细胞的浸润

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

全文总结

参考文献

文献综述 T淋巴细胞在脑出血中的研究进展

攻读硕士期间发表论文

致谢