外侧下丘脑orexin神经元与内侧前额叶皮层交互投射的亚区差异性研究

摘要

内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex,mPFC）是与意识、注意力、抉择、学习记忆等认知功能高度相关的脑区。在解剖学上，mPFC从背-腹方向可以分为前扣带区（anterior cingulate area，AC）,边缘前区（prelimbic area，PL）和边缘下区（infralimbic area，IL）；在头-尾轴上可以分为头端(rostral part)、中间段(middle part)、尾端(caudal part)。mPFC在功能上具有明显的亚区差异性。AC区与认知活动的准确性有关；PL区主要参与情绪相关的认知过程；IL区在冲动控制中起重要作用。在目标导向的认知行为中mPFC的激活具有明显的头-尾层级梯度；奖赏行为中，mPFC内与奖赏信息相关的神经活动从头端向尾端逐渐递减。mPFC相关功能的实现和维持依赖于良好的觉醒状态。觉醒是脑内特殊的皮层下促觉醒脑区上行兴奋皮层的结果。目前，对于脑内的促觉醒系统与mPFC结构和功能亚区差异性的关系仍不清楚。
　　外侧下丘脑（lateral hypothalamus，LH）的orexin神经元被认为在觉醒的产生和维持中发挥着关键性作用。回顾文献发现，LH区对mPFC的纤维投射具有明显的亚区差异性。通过逆行束路示踪技术，研究者观察到LH区神经元向AC亚区发出纤维投射的密度明显高于PL区和IL区。而对于LH区起源的神经纤维在mPFC头-尾方向上的分布差异以及靶向mPFC的神经元胞体在LH区内部的分布模式尚无报道。以往研究也证实，LH区接受来自mPFC神经元的纤维投射，但这些靶向LH的神经元在mPFC各亚区的分布模式并不明确。作为LH区重要的神经元类型之一，orexin神经元向整个中枢神经系统发出广泛的纤维投射。早期研究发现orexin受体（包括1型和2型受体，OX1R和OX2R）及orexin能纤维分布于mPFC。本课题组证实，orexin通过作用于细胞膜上的离子通道增强mPFC神经元的兴奋性。因此，促觉醒的orexin系统对于调控mPFC的活动具有重要作用。然而，对于orexin系统调控mPFC的亚区差异性以及orexin神经元所接受来自mPFC神经元的投射模式目前仍知之甚少。
　　因此，本研究采用神经束路示踪（包括顺行、逆行示踪）技术结合免疫组化技术在环路水平系统探讨了LH区orexin神经元与mPFC各亚区的交互投射模式。主要结果如下：
　　1.LH区神经元向mPFC投射的神经纤维密度自头端向尾端逐渐增加
　　为了明确LH区起源的神经纤维在mPFC不同亚区的密度分布，我们在LH区注射顺行示踪剂生物素化葡聚糖胺(biotin dextran amine，BDA)。免疫组化结果显示BDA阳性纤维在mPFC的分布具有明显的亚区差异性。首先，在PL区和IL区，BDA阳性纤维密度的分布从头端向尾端逐渐增加，提示LH区神经元向mPFC的纤维投射具有头尾层级梯度。其次，AC区的阳性纤维密度最高，PL区次之，而IL区最低。这与以往研究结果一致。
　　2.靶向mPFC区的LH区神经元胞体数量自头端向尾端依次递减
　　（1）mPFC不同亚区的全脑纤维输入图谱
　　在mPFC的不同亚区注射逆行示踪的狂犬病毒（rabies virus,RV）可选择性标记被感染神经元的单突触输入。对于PL区，在全脑范围内其接受输入纤维的密度由高到低依次为海马、扣带回、背侧丘脑、运动皮层，斜角带、眶皮质、外侧视前区、屏状核、外侧下丘脑、苍白球、杏仁核等；而IL区所接受输入纤维密度以海马最高，依次为背侧丘脑、扣带回、外侧下丘脑、运动皮层、内侧视前区、视前区、眶皮质、杏仁核、斜角带、鼻周皮层等。
　　（2）靶向mPFC不同亚区的LH区神经元胞体数量自头端向尾端依次递减
　　在本研究中，我们分别统计了RV逆行示踪阳性神经元胞体的数量分别在LH区的头端、中间段和尾端的分布。不管是在PL区还是IL区注射RV，LH区的阳性神经元的数量均呈现从头端向尾端逐渐递减的趋势。
　　3. LH区神经元主要接受PL亚区的纤维投射
　　为了明确mPFC不同亚区向LH区投射纤维的分布模式，我们首先在mPFC区注射顺行示踪剂BDA。通过免疫组化技术在LH区检测到BDA阳性纤维的分布，表明LH区接受mPFC神经元的纤维投射。然后，通过在LH区注射逆行示踪剂霍乱毒素B亚单位（cholera toxin B subunit，CTB）并计数mPFC不同亚区阳性神经元胞体的数量进一步明确靶向LH区的神经元在mPFC分布的亚区差异。结果显示，CTB阳性神经元胞体的数量在PL区明显高于AC区和IL区。因此，LH区神经元主要接受来自PL亚区的纤维投射。
　　4.Orexin能纤维与OX1R在mPFC的分布呈现自头端向尾端递增的层级分布
　　LH区包含不同类型的神经元，而BDA示踪技术并不能区分神经元的类型。因此，我们将前述经BDA顺行示踪的mPFC脑片与oreixn-A抗体孵育以阐明orexin能纤维在mPFC不同亚区的分布模式。结果发现，AC区尾端orexin能纤维的密度高于中间段；而对于PL区和IL区，orexin能纤维的分布密度均表现为从头端向尾端逐渐增加的趋势。
　　此外，我们将mPFC的脑片孵育在OX1R抗体中以研究OX1R在mPFC不同亚区的分布模式。结果提示，OX1R在AC区和PL区的密度明显高于IL区。在mPFC的三个亚区中，OX1R的分布密度从头端向尾端逐渐升高。同时，我们观察了OX1R在mPFC不同层面的表达，结果表明OX1R主要表达于mPFC的II/III层和V层，且其分布密度从头端向尾端依次增加。
　　5.PL区和IL区接受orexin神经元的单突触投射
　　将前述分别在PL区和IL区注射RV的小鼠LH区脑片在orexin-A抗体中孵育，我们发现RV阳性神经元与orexin阳性神经元存在共定位，提示orexin神经元向PL区和IL区均发出直接的单突触投射。
　　6.Orexin神经元接受来自mPFC的纤维投射
　　将前述在mPFC区注射BDA示踪剂的大鼠LH区脑片在orexin-A抗体中孵育，免疫组化结果显示在LH区orexin-A阳性神经元胞体周围分布大量BDA阳性神经纤维，提示orexin神经元接受来自mPFC的纤维投射。
　　综上所述，在本研究中，一方面我们发现LH区orexin神经元向mPFC各亚区发出的投射纤维密度从头端向尾端逐渐增加，而靶向mPFC的LH区orexin神经元胞体数量在其内部呈现头-尾逐渐递减的梯度趋势。OX1R的分布密度不管是在AC，PL，IL三个亚区内还是在mPFC不同的层面也表现出由头端向尾端递增的模式。另一方面，mPFC神经元也发出纤维投射至LH区，并与orexin神经元的胞体形成联系。靶向LH区的mPFC神经元胞体在PL亚区分布最集中。以上结果为进一步明阐明促觉醒的orexin系统与高级认知功能相关的mPFC之间的交互调控模式提供了解剖学和组织学的依据。

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第一章 前言

第二章 LH区与mPFC各亚区之间的纤维交互投射

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

第三章 mPFC区与orexin神经元的纤维交互投射

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述: Orexin系统的生理功能及机制研究进展

硕士期间发表的论文

致谢