噬菌体在烧伤泛耐药细菌感染治疗中的应用研究

摘要

感染是严重烧伤的主要并发症，轻者可延误创面愈合，重则可诱发脓毒症，甚至多器官功能衰竭，是烧伤死亡的主要原因。严重烧伤患者由于体表生理防御屏障受损、全身免疫功能下降、坏死组织广泛存在以及外界或自身菌群侵袭，其感染易感性大大增加。因此，烧伤感染的防治一直是烧伤救治领域的热点和难点问题[1，2]。
　　随着抗生素在临床上长期、广泛和大量使用，细菌耐药性的出现及日益严重化给临床抗感染治疗带来了严峻挑战[3]。而烧伤病房中常见的细菌鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)[3,4]、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[5-8]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[3,9-11]和克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae）[10]等都是目前报道的耐药率很高，耐药现象非常普遍的几大类细菌。由于传统的抗生素的研发进展非常缓慢，亟需其他的抗菌手段。在本次课题中，我们主要做了以下四个方面的研究:1）对自己医院烧伤病房的鲍曼不动杆菌进行了广泛和全面的分子流行病学调查;2）分析噬菌体内溶素PlyAB1在应对泛耐药鲍曼不动杆菌感染中的应用;3）用细胞实验和动物实验初步分析了鲍曼不动杆菌噬菌体Abp1的安全性和有效性;4）分析CRISPR在抗感染领域的应用。结果总结如下:
　　1.对3年来的烧伤患者血液分离鲍曼不动杆菌分析，共收集到81株细菌。大多数菌株为多重耐药菌株。除了多粘菌素B尚未发现有耐药菌株外，米诺环素和头孢哌酮钠舒巴坦钠的耐药率在30％和75％左右，剩下16种抗生素耐药率高达90％以上。同时，这些细菌中耐药基因检出率高，检测率较高的耐药基因依次是OXA51、OXA23、AmpC、IS-AmpC、PER和SIM，其检测率分别是96.3％，92.6％，86.4％，72.7％，72.7％和51.9％。81株血液分离菌被分到28个ST型别中，包含了10个已知的ST型别和18个新的ST型别。除了5个ST型（ST457，STn2，STn6，STn11和STn14）不属于同一个克隆群，其余23个ST型的菌株（共76株）均属于同一个克隆群，克隆复合体92。这也是目前世界上流行最多的鲍曼不动杆菌克隆复合体。
　　2.进一步对三年来分离的耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌进行分析，共收集了248株细菌。主要分离部位依次是伤口表面(41％)、痰液(24％)、导管(15％)和血液(14％)四个部位，共占了全部样本的94％。耐药基因OXA23的检出率呈现了上升趋势，OXA23的检出率从2012年的39％升高至2013年的77％。而且在不同的ST型别的细菌中，OXA23的携带率明显不同，在ST95和ST191中，OXA23的检出率仅为10％，但是在ST369中，90％(26/29)的菌株携带有OXA23基因。ST368始终是过去三年中的主导型别，但它所占的比例有所下降。同时ST型别组成也是每年都在发生变化，部分ST型别消失，部分新ST型别显现出来。进化分析提示这248株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌大部分遗传关系相近，这也提示我们控制医院感染是鲍曼不动杆菌感染防治中的重要一步。
　　3.经过两次去内毒素纯化后，噬菌体原液中内毒素的含量降低了400多倍，从7.03*105EU/ml降低到了1.70*103EU/ml。使用Hela细胞和THP-1细胞研究了噬菌体对细胞的体外毒性作用，证实高达1010PFU/ml的噬菌体作用过夜后未检测到明显的细胞毒性。细胞实验表明，Hela细胞感染鲍曼不动杆菌2个小时后，给予MOI为100的噬菌体治疗，可以达到拯救细胞被细菌感染而杀死的目的。最后，使用创面局部感染鲍曼不动杆菌和小鼠全身感染鲍曼不动杆菌模型，证实了噬菌体Abp1对于AB1引起的局部感染和全身感染都有很好的治疗作用。
　　4.基于前期的噬菌体基因组测序，寻找到了一个新的鲍曼不动杆菌噬菌体内溶素，进一步克隆表达和纯化了该内溶素PlyAB1。证实PlyAB1蛋白约21Kda左右，PlyAB1能迅速裂解鲍曼不动杆菌AB1，使得其OD600在30分钟内从1.0下降至0.2，活菌数量从1.4×107CFU/ml降至4.1×106CFU/ml。除了宿主菌AB1，还能裂解临床分离的属于不同型别的48株泛耐药鲍曼不动杆菌。
　　5.最后，使用CRISPR技术，通过抑制细菌的prtR基因的表达，控制细菌的数量。首先，我们成功将CRISPR-Cas9系统成功置入到铜绿假单胞菌中，进而用携带CRISPR-Cas9系统的重组质粒PHERDB20T-dCas9-prtR sgRNA证实它可以降低铜绿假单胞菌达103倍数量级。这些结果也证实了CRISPR技术在抗菌领域的应用潜能。
　　综上所述，我们首先对病房中鲍曼不动杆菌进行流行病学分析，发现这些菌株耐药率高，耐药基因携带率也很高，而且大部分菌株属于克隆复合体92。细胞实验分析了噬菌体的安全性和有效性。并用动物创面感染实验进一步证实，噬菌体在全身及创面感染中的应用。还发现了一个新的鲍曼不动杆菌噬菌体内溶素，对临床分离的泛耐药鲍曼不动杆菌有较好的杀菌效果。最后我们尝试使用CRISPR技术来控制细菌的感染，初步证实了其潜在的应用价值。

目录

声明

缩略语表

摘要

前言

第一章 烧伤病房中鲍曼不动杆菌的流行病学调查

1．1 血液分离鲍曼不动杆菌流行病学调查

1．2 耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌流行病学调查

第二章 噬菌体的安全性和有效性

2．1 去除噬菌体原液中的内毒素

2．2 噬菌体安全性和体外杀菌实验

2．3 噬菌体治疗小鼠创面感染和全身感染

第三章 噬菌体内溶素的裂解研究

3．1 试剂与材料

3．2 实验方法

3．3 结果

3．4 讨论

第四章 利用CRISPR靶向清除含有特定基因的细菌

4．1 试剂与材料

4．2 实验方法

4．3 结果

4．4 讨论

全文总结

参考文献

文献综述 噬菌体内溶素研究进展

附录

攻读博士期间发表的文章

致谢