去甲肾上腺素对脑桥尾侧网状核神经元活动的调控作用及机制研究

摘要

中枢去甲肾上腺素(noradrenaline，NA)能系统在多种重要的生理功能中发挥了重要的调节作用。脑干中的蓝斑核(locus coeruleus，LC)是中枢NA的主要来源。尽管NA能神经元的分布主要位于脑干当中，但由这些神经元所发出的纤维广泛投射至包括脊髓在内的整个中枢神经系统。在中枢的不同脑区当中，主要存在三种受体，包括α1、α2以及β受体，介导了NA对不同脑区神经元活动及相关功能的调控。然而，鉴于其受体种类繁多，并且分布模式以及激活后对神经元活动的影响均呈现出多样性，NA参与不同生理功能的细胞分子机制也十分复杂多样，并因此引起了广泛的关注。
　　脑桥尾侧网状核(caudal pontine reticular nucleus，PnC)是mPMRF的重要组成部分，PnC中的网状脊髓神经元介导了震惊运动(startle)这一姿势调节运动。已有研究表明，在PnC中微量注射NA可以对大鼠震惊反射运动行为的幅度产生显著的调节作用，据此我们推测NA可能通过调控PnC网状脊髓神经元，参与其介导的中枢运动功能调节。回顾文献，目前尚无NA对PnC网状脊髓神经元活动调控机制的报道。因此，本文综合采用形态学、全细胞膜片钳以及神经药理学技术，在细胞水平系统探索了NA对PnC网状脊髓神经元的调控及机制。主要结果如下:
　　1.α1以及α2受体共表达于单个PnC网状脊髓神经元中，其激活共同介导了NA对PnC网状脊髓神经元全细胞电流活动的影响。
　　为了明确NA作用于PnC网状脊髓神经元的电生理效应，我们将其钳制在-70 mV，观察短暂(3 min)灌流3μM的NA引起的全细胞电流变化。研究结果表明，NA(3μM)在一部分PnC网状脊髓神经元中诱发内向电流反应(82/135例，60.7％)，而在另一部分PnC神经元中诱发外向电流反应(53/135例，39.3％)。无论是NA诱发的内向(P=0.364，n=6)还是外向(P=0.511，n=6)电流反应，均不受TTX(1μM)的影响，提示突触后的NA能受体介导了NA的效应。结合药理学手段研究后发现，NA所诱发的内向电流反应可以被低浓度α1受体阻断剂prazosin(Pra，0.01μM)部分阻断(P＜0.05，n=7)，但高浓度的Pra(10μM)使NA在同一神经元中反转为引起内向外向电流反应。只有同时加入Pra(10μM)以及α2受体阻断剂yohimbine(Yh，10μM)方可完全阻断NA(3μM)对该神经元全细胞电流的影响(P＜0.01，n=7)。应用同样方法研究后发现，NA所诱发的外向电流反应可以被低浓度α2受体阻断剂Yh(0.01μM)部分阻断(P＜0.01，n=6)，但高浓度的Yh(10μM)使NA在同一神经元中反转为引起内向电流反应。只有同时加入Pra(10μM)以及Yh(10μM)方可完全阻断NA(3μM)对该神经元全细胞电流的影响(P＜0.01，n=6)。上述结果表明，PnC网状脊髓神经元突触后共表达有α1和α2受体，其激活在电压钳钳制于-70 mV的PnC网状脊髓神经元中分别介导了内向和外向电流成分，两者经过不同整合后，表现为NA在一部分神经元诱发内向电流，而在另一部分诱发外向电流。与此相一致的是，免疫荧光双标结果表明，α1A和α2A受体亚型共表达于PnC中胞体直径大于35μm的网状脊髓神经元中。
　　2.突触后α1和α2受体的激活，分别增加和抑制同一PnC网状脊髓神经元的放电活动。
　　本实验中灌流的ACSF中加入了CNQX(10μM)、AP5(20μM)和picrotoxin(100μM)，以阻断PnC中的主要兴奋及抑制性突触传递。在此基础上，我们于电流钳模式(I=0)模式，直接记录PnC网站脊髓神经元的放电活动。在该条件下，所有记录的6例神经元均表现出自发放电活动(平均放电频率:4.5±1.5 Hz;频率变化范围:1.7～11.6 Hz)。ACSF灌流α1受体的激动剂phenylephrine(PE，100μM)显著增加了PnC网状脊髓神经元的放电频率(P＜0.05;n=6);而在同一个的神经元中，ACSF灌流α2受体的激动剂则显著降低了PnC网状脊髓神经元的放电频率(P＜0.05;n=6)。该结果不仅进一步确认了实验室前期电压钳实验的结果，更进一步揭示了PnC网状脊髓神经元突触后α1以及α2受体的激活可以在神经元活动层次对神经元兴奋性分别起到相反的动态调节作用。
　　3.PnC网状脊髓神经元突触后α1和α2受体激活分别偶联的离子通道机制。
　　在全细胞膜片钳电压钳条件下，应用缓慢的斜坡电压(slowramp)刺激(-125 mV～+5mV，dV/dt=+10 mV/s)，我们可以得到α1以及α2受体激动剂在PnC网状脊髓神经元上所诱导的净电流的电流-电压关系曲线(I-V relationship curve)。
　　(1)突触后α1受体的激活，通过开放下游非选择性阳离子通道调控PnC网状脊髓神经元活动。
　　通过分析发现，应用PE(100μM)激活α1受体所得到的净电流的平衡电位(mean:-29.1±3.0 mV;n=15)接近于文献报道的非选择性阳离子通道电导(nonselective cationicconductance，NSCC)的平衡电位。并且在测试电压范围内其I-V曲线均呈现出正向斜率，提示该通道开放介导了α1受体激活对PnC网状脊髓神经元的兴奋性调控效应。进一步应用离子置换实验降低胞外Na+浓度(由152.5 mM降至70 mM)不仅显著降低了α1受体激活后引起的净电流大小(P＜0.01;152.5 mM Na+:n=40;70 mM Na+:n=11)，α1受体激活所得到的净电流的平衡电位也符合预期的向更负的方向移动(-42.9±4.2 mV;P＜0.05;152.5 mMNa+:n=15;70mMNa+: n=9)。上述结果表明，α1受体激活后可以激活NSCC，调控PnC网状脊髓神经元活动。文献报道NSCC主要包含Na+以及K+成分，进一步应用翻转电位以及戈德曼-霍奇金-卡茨方程(Goldman-Hodgkin-Katz equation)计算得出在不同胞外Na+浓度下的Na+/K+通透比例后发现，在两种情况下其比例并无显著差异(P=0.702;n=9)。该结果表明，α1受体激活后可能仅与NSCC相偶联。
　　(2)突触后α2受体的激活，通过关闭非选择性阳离子通道和开放K+通道调控PnC网状脊髓神经元活动。
　　激活α2受体所得到的净电流的平衡电位(mean:-23.5±4.3 mV;n=10)同样接近于NSCC的平衡电位但略高于激活α1受体所得到的净电流的平衡电位(mean:-29.1±3.0mV;n=15)。此外，在其中3列神经元中，除接近于NSCC平衡电位的交点外，激活α2受体所得到的净电流同时还存在接近K+平衡电位的交点(mean:-99.3±4.3 mV)。该结果提示，与α1受体不同，α2受体下游可能同时偶联了NSCC以及K+电导。进一步的离子置换实验表明，胞外Na+浓度由152.5 mM降至70 mM显著减弱了α2受体激活后所引起的净电流幅度(P＜0.01;152.5 mM Na+:n=25;70 mM Na+:n=10)。与此同时，胞外Na+浓度由152.5 mM将至70 mM后，α2受体激活后所引起的净电流在绝大多数测试的神经元(n=6/7)中均呈现出两个平衡电位:-109.9±4.7 mV(依然接近于K+平衡电位，并且在低Na+条件下出现概率增大)和-28.2±1.0 mV(明显高于低Na+条件下NSCC平衡电位的期待值，该期待值来自低Na+条件下α1受体激活后的平衡电位，-42.9±4.2mV)。值得注意的是，在剩下的1个神经元中，α2受体激活后所引起的净电流仅呈现出一个平衡电位，-44.0 mV，接近于低Na+条件下NSCC平衡电位的期待值。该结果表明，α2受体激活偶联了K+通道，并且K+通道的活动可能显著影响在低Na+(70 mM)条件NSCC平衡电位的观测值，并使其向更正的方向移动。的确，在ACSF中加入K+通道广谱阻断剂Ba2+后，α2受体激活后引起的净电流幅度进一步显著减少(P＜0.05;70 mM Na+:n=10;1 mM Ba2+:n=6)，并且此时α2受体激活后引起的净电流平衡电位仅存在一个，-44.7±1.3 mV(n=6)，与上述低Na+条件下NSCC平衡电位的期待值也不在存在显著差异(P=0.370)。该结果表明，α2受体激活后可以同时偶联K+以及NSCC两种电导。并且在阻断钾离子后计算α2受体偶联NSCC的Na+/K+通透比与α1受体所偶联NSCC的Na+/K+通透比并不存在显著差异(P=0.671;α1:n=24;α2:n=6)，进一步说明两者偶联的为同一类NSCC通道。对α2受体激活引起的净电流I-V关系分析发现，其在接近K+平衡电位呈现出正向斜率而在接近NSCC附近呈现出负向斜率，说明起激活后可以激活K+电导并关闭NSCC。
　　4.α2受体同时还表达于PnC网状脊髓神经元突触前，并介导了NA对mEPSC的抑制性调控作用。
　　综上所述，本文研究结果系统阐明了NA对PnC网状脊髓神经元突触后以及突触前的调控效应和机制。该研究结果为NA直接调控中枢运动相关脑区神经元活动，并参与中枢运动功能调节提供了新的神经机制，并为我们下一步的行为学水平研究提供了新的方向。

目录

声明

英文缩略一览表

摘要

第一章 前言

第二章 去甲肾上腺素对脑桥尾侧网状核神经元活动的突触后效应及机制

2．1 实验材料和方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 去甲肾上腺素对脑桥尾侧网状核神经元的突触前效应及机制

3．1 实验材料和方法

3．2 结果

3．3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述 蓝斑去甲肾上腺素能系统结构与功能的研究进展

硕士期间发表的论文

致谢