LB-100对宫颈癌细胞Ca ski辐射敏感性及肠道作用的实验研究

摘要

背景和目的：
　　社会人口老龄化及环境污染，致使恶性肿瘤的发病率不断升高，成为导致死亡的最主要原因。在妇科肿瘤中，宫颈癌的死亡率最高，且近年来出现了年轻化的趋势。尤其是在中国等亚洲国家，HPV病毒广泛感染，导致宫颈癌在这些国家的发病率更高。早期宫颈癌的治疗手段主要是放疗，或手术联合放疗，效果较好。但是，放射线对组织的破坏作用是无选择性的，且宫颈位于盆腔，其邻近组织——肠道，对放射线异常敏感。因此，宫颈癌接受放疗的患者常不可避免地并发放射性肠损伤，患者表现为腹痛、腹泻、便血，远期甚至会导致肠梗阻等严重情况，加重了患者心理、生理以及经济上的负担，也极大地加重了临床护理的工作量。若通过降低放疗剂量来避免肠道并发症，又会导致宫颈癌消除不彻底，远期发生转移和复发。因此，需要一种能增强宫颈癌细胞辐射敏感性的药物，联合放疗来治疗宫颈癌。以此在不影响抗肿瘤效果的情况下，可降低辐射剂量，尽可能地避免放射性肠损伤发生，进而可减轻患者及临床护理工作的负担。
　　PP2A(Protein phosphatase2，蛋白磷酸酶)是一种参与细胞周期、DNA损伤应答等的调节蛋白。研究证明，外源性抑制剂，如岗口酸和斑螯素，通过抑制PP2A的活性，改变肿瘤细胞的细胞周期进程及DNA损伤应答机制，从而增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性。LB-100是PP2A的一种新研发的水溶性抑制剂，动物荷瘤模型上证明其能够有效增强骨肉瘤、卵巢癌等移植瘤对放化疗的敏感性，且其对肝、肾等重要组织脏器无明显毒副作用，目前处于Ⅰ期临床研究阶段。但还未见LB-100对宫颈癌作用的相关研究报道。
　　由于宫颈癌放疗常不可避免地造成放射性肠损伤，患者承受着生理和心理上的痛苦，也促使其治疗和护理面临巨大的困难，因此在研究增强宫颈癌放疗敏感性药物的同时，应该关注该药物对肠道组织的作用。
　　综合以上因素，本研究以Ca ski（人宫颈癌细胞株）和CCD841CoN（人正常肠上皮细胞株）及HIEC(人正常肠上皮细胞株)为研究对象，探讨了PP2A抑制剂LB-100对宫颈癌细胞株Ca ski辐射敏感性的影响，以及其对正常肠上皮细胞株CCD841CoN及HIEC增殖及辐射敏感性的影响。同时，本研究利用小鼠放射性肠损伤模型，初步观察了LB-100对小鼠正常肠道组织以及放射性肠损伤的肠道组织的影响，以期为宫颈癌的临床放射治疗和患者受照后的护理提供一定的指导。
　　方法:
　　1.LB-100药物浓度筛选:梯度浓度的LB-100分别处理Ca ski、CCD841CoN和HIEC细胞，24hr后用CCK-8法检测以上细胞的细胞活性，最终选择对两株人正常肠上皮细胞无抑制作用的浓度作为安全给药浓度。
　　2.48hr细胞活性检测（Ca ski、CCD841CoN和HIEC细胞）:将细胞分别分组为对照组(control)、单纯LB-100组(LB)、单纯辐照组(R)、LB-100联合辐照组(LB+R)，给予低浓度LB-100（2.5μM）和（或）辐照(6Gy)处理，辐照(6Gy)后48hr，以CCK-8试剂检测细胞活性。
　　3.平板克隆形成实验（Ca ski、CCD841CoN和HIEC细胞）:细胞分组方法同2，分别给予LB-100（2.5μM）和（或）辐照(0Gy、2Gy、4Gy、6Gy)处理，24hr后去除LB-100继续培养，至克隆形成后进行染色并计数。
　　4.流式细胞术凋亡检测(Ca ski):细胞分组方法同2，LB-100(2.5μM)和（或）辐照(6Gy)处理人宫颈癌细胞株Ca ski，3hr后给予辐照(6Gy)，于辐照后24hr和48hr以流式细胞术检测凋亡。
　　5.流式细胞术细胞周期检测(Ca ski):细胞分组和处理方法同4，于辐照后24hr以流式细胞术检测细胞周期。
　　6.免疫荧光染色(Ca ski):细胞分组为对照组(control)和单纯LB-100组(LB)，LB-100(2.5μM)处理48hr后，进行免疫荧光染色（DAPI和Tublin）。
　　7.体内实验:BALB/c小鼠分组为对照组(control)、单纯LB-100组(LB)、单纯辐照组(R)、LB-100联合辐照组(LB+R)。给予LB-100(2.5mg/kg)或等体积生理盐水腹腔注射，3hr后给予一次性全身辐照11Gy或0Gy。并于辐照后24hr、48hr、72hr分别给予一次LB-100(2.5mg/kg)或者等体积生理盐水腹腔注射并观察记录小鼠基本状态，于辐照后84h颈部脱臼处死小鼠，获取小鼠肠道组织，测量小肠肠度，进行肠道组织HE和Brdu染色。
　　结果:
　　1.LB-100药物浓度筛选结果显示:当浓度小于5μM时，LB-100对以上三种细胞的细胞活性均无明显抑制作用，当浓度≥5μM时，LB-100对以上三种细胞活性的抑制作用明显，呈浓度依赖趋势。
　　2.48hr细胞活性检测结果显示:与control组比较，Ca ski细胞的LB组细胞活性降低，而CCD841CoN和HIEC的LB组细胞活性无差异，以上三种细胞的R组的细胞活性均降低。与R组比较，Ca ski的LB+R组的细胞活性降低更明显，而CCD841CoN和HIEC的LB+R组细胞活性与R组比较无显著差异。
　　3.平板克隆形成实验结果显示:Ca ski和CCD841CoN的LB组的克隆数小于control组，而HIEC的LB组的克隆数与control组比较无差异。以上三种细胞的R组的细胞克隆数均小于control组。Ca ski的LB+R组的细胞克隆数少于R组和LB组。CD841CoN和HIEC的LB+R组的克隆数与R组比较无显著差异。
　　4.Ca ski细胞凋亡凋亡结果显示:LB组和R组凋亡率显著高于control组，LB+R组的凋亡率明显高于单纯LB和R组。
　　5.Ca ski细胞周期检测结果显示:LB组和R组细胞周期的G0/G1期比例低于control组，但LB+R组G0/G1期比例低于LB组和R组。
　　6.Ca ski细胞免疫荧光染色结果显示:control组Ca ski细胞核形态正常及微管结构完整，而LB组大量异常核出现且细胞核体积较control组大，微管的结构消失。
　　7.从小鼠的体重等基本情况、肠道组织的病理切片HE染色以及隐窝增殖染色的情况来看，LB组与control组比较无显著差异。LB+R组与R组小鼠的体重下降，小肠长度变短，肠上皮结构被严重破坏，但两组之间比较无差异。
　　结论:
　　1.浓度低于5μM时，LB-100对Ca ski细胞无明显毒性作用，可选择较低浓度LB-100（2.5μM）作为后续实验的给药浓度。低浓度LB-100能增强宫颈癌细胞Ca ski的辐射敏感性。LB-100增强Ca ski细胞辐射敏感性的可能机制是诱导Ca ski细胞凋亡，促进Ca ski细胞的细胞周期进程，破坏Ca ski细胞微管结构，导致多倍体及异常核形成，最终导致Ca ski细胞发生有丝分裂性死亡。
　　2.浓度低于5μM时，LB-100对CCD841CoN和HIEC细胞无明显毒性作用，视作安全浓度范围。低浓度LB-100对正常肠上皮细胞CCD841CoN和HIEC的辐射敏感作用无影响。LB-100对小鼠正常肠道组织无副作用，且未加重放射性肠损伤模型小鼠的肠损伤程度，但其对损伤的肠道组织也无明显保护作用。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

1．1 选题依据

1．2 研究背景

1．3 研究意义

1．4 研究内容

1．5 研究方法

第二章 LB-100对宫颈癌细胞Ca ski辐射敏感性的研究

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 LB-100对肠道作用的研究

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 小结

全文结论

参考文献

文献综述 蛋白磷酸酶2A在肿瘤发生及增加肿瘤放化疗敏感性的研究进展

攻读学位期间发表的论文

致谢