IL-23/IL-17轴在脑出血继发性炎症损伤中的作用及机制

摘要

目的：
　　本研究中，我们应用小鼠自体血ICH模型，研究巨噬细胞和淋巴细胞及它们的细胞因子IL-23和IL-17在ICH继发性炎症损伤中的作用。在此基础上，利用离体及在体ICH模型，探讨了Hb诱导巨噬细胞表面TLR2/TLR4二聚体形成在ICH继发性炎症损伤中的作用。最后观察了中药提取物SsnB破坏TLR2/TLR4二聚体形成对IL-23/IL-17炎症轴的阻断作用。我们的研究从外周免疫细胞参与ICH继发性炎症损伤的角度出发揭示ICH继发性炎症损伤的新机制，可望建立可行的免疫调控靶点，为脑出血免疫学治疗提供新途径。
　　第一部分:外周巨噬细胞和T淋巴细胞参与脑出血继发性炎症损伤
　　目的:
　　明确外周巨噬细胞和T淋巴细胞在ICH后的数量变化及其在继发性炎症损伤中的作用
　　方法:
　　利用WT小鼠制备自体血ICH模型，流式细胞术(FACs)及免疫荧光染色检测血肿同侧大脑半球炎症细胞各亚型的数量变化情况。分别利用磷酸二钠脂质体(CLPs)删除小鼠体内巨噬细胞，芬戈莫德(Fingolimod)阻断淋巴细胞向小鼠脑内迁移，并利用Rag1-/-小鼠建立转移性过继模型，在此基础上制备小鼠自体血ICH模型，FACs检测血肿同侧大脑半球巨噬细胞、T淋巴细胞数量变化，同时检测小鼠脑水肿含量及神经功能缺损情况，明确巨噬细胞和T淋巴细胞在ICH继发性炎症损伤中发挥何种作用。
　　结果:
　　1、FACs结果显示血肿同侧大脑半球CD45+细胞（包括CD3+、CD4+、γδT细胞）绝对数显著增高，以ICH4d最高;巨噬细胞绝对数显著增加，于ICH1d达峰值;小胶质细胞数量无变化。免疫荧光染色发现，在血肿周围有大量F4/80+细胞和CD3+细胞。
　　2、与WT小鼠相比，CLPs删除巨噬细胞的小鼠，ICH后血肿同侧大脑半球巨噬细胞数量显著减少，T淋巴细胞数量无明显变化，神经功能缺损评分较低、脑水肿减轻。
　　结论:
　　ICH后血肿周围脑组织中巨噬细胞、T淋巴细胞数量增加。删除小鼠体内巨噬细胞后，ICH小鼠NDS评分减少、脑水肿含量下降，提示巨噬细胞浸润加重ICH继发性炎症损伤。阻断淋巴细胞向脑内浸润后，ICH小鼠NDS评分减少、脑水肿含量下降;过继了WT小鼠CD3+细胞的Rag1-/-小鼠ICH后NDS评分增加、脑水肿含量增加，提示外周T淋巴细胞浸润加重ICH继发性炎症损伤。
　　第二部分:巨噬细胞分泌IL-23加重脑出血继发性炎症损伤
　　目的:
　　明确IL-23在ICH继发性炎症损伤中的作用并明确IL-23的来源
　　方法:
　　利用WT小鼠制备自体血ICH模型，WB和qPCR检测血肿周围脑组织IL-23蛋白及mRNA表达变化。利用WT、IL-23-/-小鼠分别制各自体血ICH模型，免疫荧光和TUNEL检测标记血肿周围脑组织凋亡神经元，qPCR检测血肿周围脑组织及炎症细胞中炎症因子的表达变化，同时进行小鼠神经功能缺损评分、检测脑水肿含量。
　　结果:
　　1、WB检测到ICH小鼠血肿周围脑组织IL-23蛋白表达增高，ICH1d最高;qPCR结果与wB一致。
　　2、与WT小鼠相比，IL-23-/-小鼠ICH后神经功能缺损评分降低、脑水肿减轻，血肿周围脑组织凋亡神经元数量减少，血肿同侧半球炎症细胞中IL-1β、TNFα mRNA表达降低。
　　3、血肿同侧半球炎症细胞中IL-23mRNA的表达在ICH1d最高;流式分选后使用qPCR检测发现IL-23mRNA仅在巨噬细胞中表达。
　　结论:
　　ICH后血肿周围脑组织IL-23蛋白及mRNA表达均增高，IL-23-/-小鼠ICH后神经功能缺损评分降低、脑水肿减轻，血肿周围脑组织凋亡神经元数量减少，血肿同侧半球炎症细胞中IL-1β、TNFα mRNA表达降低，提示IL-23参与并加重ICH继发性炎症损伤。ICH后血肿周围脑组织及血肿同侧半球炎症细胞中IL-23表达均在1d最高，与ICH后巨噬细胞数量达峰时间一致，提示巨噬细胞可能是IL-23的主要来源。流式分选后qPCR检测发现IL-23mRNA仅在巨噬细胞中表达，进一步明确了ICH后巨噬细胞是脑内IL-23的来源。
　　第三部分:IL-23促进γδT细胞分泌IL-17加重ICH继发性炎症损伤
　　目的:
　　明确IL-17在ICH继发性炎症损伤中的作用及IL-17的来源，并证实IL-23对IL-17产生具有作用。
　　方法:
　　用WT小鼠制备自体血ICH模型，WB和qPCR检测血肿周围脑组织IL-17蛋白及mRNA表达变化。利用WT、IL-17-/-、γδCR-/-小鼠分别制备自体血ICH模型，免疫荧光及TUNEL检测血肿周围脑组织神经元凋亡，FACs检测血肿同侧大脑半球炎症细胞各亚型的数量变化，qPCR检测血肿周围脑组织及炎症细胞中炎症因子的表达变化，免疫荧光检测血肿周围CD3与IL-17的共标，同时评价小鼠神经功能缺损评分、脑水肿含量。
　　结果:
　　1、WB检测到ICH小鼠血肿周围脑组织IL-17蛋白表达增高，ICH4d最高;qPCR结果与WB一致。
　　2、与WT小鼠相比，IL-17-/-小鼠ICH后神经功能缺损评分降低、脑水肿减轻;血肿周围脑组织凋亡神经元数量减少;血肿同侧半球CD45+细胞（包括小胶质细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞）数量无显著变化;血肿周围脑组织及血肿同侧半球炎症细胞中IL-1β、TNFα mRNA表达显著降低。
　　结论:
　　ICH后血肿周围脑组织IL-17蛋白及mRNA表达均增高，IL-17-/-小鼠ICH后神经功能缺损评分降低、脑水肿减轻，血肿周围脑组织凋亡神经元数量减少，血肿周围脑组织及血肿同侧半球炎症细胞中IL-1β、TNFα mRNA表达均降低，提示IL-17参与并加重ICH继发性脑损伤。ICH后血肿周围脑组织IL-17蛋白及mRNA表达在4d最高，血肿同侧半球炎症细胞中IL-17+细胞数量的表达也在ICH后4d最高，与ICH后T淋巴细胞数量达峰时间一致，提示T淋巴细胞可能是IL-17的主要来源，免疫荧光检测发现IL-17和CD3共标，FACs检测IL-17+细胞表面标志物，发现大部分IL-17+细胞表达CD3，均提示IL-17主要来CD3+T淋巴细胞。进一步流式分析后发现γδT细胞是IL-17的主要来源。IL-23-/-小鼠血肿同侧大脑半球IL-17+细胞百分比显著降低，提示IL-23对IL-17的生成具有关键作用。
　　第四部分:Hb诱导巨噬细胞TLR2/4二聚体形成启动IL-23/IL-17炎症轴
　　目的:
　　证实Hb诱导巨噬细胞TLR2/4二聚体形成，及其在ICH继发性脑损伤中的作用
　　方法:
　　用WT小鼠制备自体血ICH模型，培养小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMM)，Hb刺激建立离体模型。免疫共沉淀(co-IP)检测ICH后巨噬细胞表面TLR2/4二聚体，免疫荧光多重标记检测F4/80、TLR2、TLR4共标。建立骨髓嵌合鼠，制备ICH模型，免疫荧光及TUNEL检测血肿周围脑组织神经元凋亡，同时评价小鼠神经功能缺损评分、脑水肿含量。qPCR检测不同基因型小鼠BMM受到Hb刺激后IL-23mRNA表达。SsnB处理BMM及ICH小鼠，qPCR检测BMM及血肿周围脑组织IL-23、IL-17、IL-1β、TNFαmRNA表达变化，同时评价小鼠神经功能缺损评分、脑水肿含量。
　　结果:
　　1、免疫荧光多重标记检测血肿周围脑组织可见F4/80、TLR2、TLR4共标;co-IP检测发现ICH小鼠脑中分离的巨噬细胞有TLR2/4共沉淀，脾中分离的巨噬细胞无TLR2/4共沉淀;
　　2、co-IP检测发现在血肿成分Hb，hemin，bilirubin，Fe2+，and Fe3+中，仅Hb可刺激的BMM有TLR2/4共沉淀;免疫荧光检测Hb刺激的BMM可见F4/80、TLR2、TLR4共标。
　　3、与接受WT BMM移植的TLR2/TLR4双敲小鼠相比，接受TLR2/TLR4双敲BMM移植的WT小鼠ICH后神经功能缺损评分减低，脑水肿减轻，血肿周围凋亡神经元数量减少。
　　4、Hb刺激不同基因型小鼠BMM后，qPCR检测发现TLR2或TLR4单独敲除组IL-23mRNA表达低于WT组，TLR2/TLR4双敲组低于单独敲除组，MyD88敲除组几乎检测不到 IL-23mRNA表达，TRIF敲除组与WT组相比无差异。
　　结论:
　　co-IP检测发现ICH小鼠脑中分离的巨噬细胞有TLR2/4共沉淀，脾中分离的巨噬细胞无TLR2/4共沉淀，提示ICH后浸润入脑内的巨噬细胞表面形成TLR2/4二聚体，外周巨噬细胞无TLR2/4二聚体形成，免疫荧光证实了这一结果。co-IP检测发现在血肿成分Hb，hemin，bilirubin，Fe2+，and Fe3+中，仅Hb的刺激BMM可见TLR2/4共沉淀，提示Hb诱导从而促进巨噬细胞活化产生IL-23，加重ICH继发性脑损伤。SsnB能阻断TLR2/4二聚体形成，从而抑制IL-23、IL-17生成，减轻ICH继发性脑损伤。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 外周巨噬细胞和T淋巴细胞参与脑出血继发性炎症损伤

2．1 实验材料和方法

2．2 实验结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 巨噬细胞分泌IL-23加重脑出血继发性炎症损伤

3．1 材料和方法

3．2 实验结果

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 IL-23促进γδT细胞分泌IL-17加重脑出血继发性炎症损伤

4．1 材料和方法

4．2 实验结果

4．3 讨论

4．4 小结

第五章 Hb诱导巨噬细胞TLR2／4二聚体形成启动IL-23／IL-17炎症轴

5．1 材料和方法

5．2 实验结果

5．3 讨论

5．4 小结

全文总结

参考文献

文献综述 IL-23／IL-17免疫轴：发现、机制与临床试验

攻读学位期间的研究成果

致谢