Id3在慢性病毒感染中对CD8+T细胞表型及功能的调控

摘要

慢性病毒感染，如HIV，HBV，HCV感染等严重威胁着人类健康，其中尤以HIV病毒感染是目前医学研究领域的难题和热点。目前临床针对HIV主要采取HAART疗法，但是HAART治疗无法完全清除人体内所有潜伏的HIV病毒。HIV病毒在感染后早期即可侵入淋巴滤泡内的TFH细胞并潜伏起来从而逃过HAART药物治疗和免疫细胞的杀伤，这些被感染的TFH细胞成为彻底治愈HIV患者的最大障碍。因此除外源性药物治疗外，有必要更加深入的了解慢性病毒感染情况下的免疫影响机制，为增强机体免疫系统清除病毒和免疫监视能力从而进一步控制感染提供新的治疗策略。
　　在免疫系统中，CD8+T细胞通过杀伤被病毒感染的靶细胞而成为控制病毒感染的主要细胞亚群。在急性病毒感染过程中，CD8+T细胞被激活后开始大量增殖，并且在短期内迅速清除体内的病毒。随之在失去抗原刺激后大部分CD8+T细胞走向凋亡，但是其中仍有少量细胞继续生存下来并分化为病毒特异性的记忆性CD8+T细胞。这些记忆性CD8+T细胞能够对相同抗原再次快速产生效应，同时具有很强的增殖潜力并且可以在没有抗原的情况下长期维持稳态增殖，从而为机体提供长久的保护。相反，在慢性病毒感染中，CD8+T细胞无法完全清除病毒，并长期接受病毒抗原的刺激以及其它抑制性信号的调节，从而随着病毒感染的进程而逐渐丧失自身的功能，最终走向耗竭(exhaustion)。
　　慢性病毒感染中的CD8+T细胞表面开始逐渐表达多种抑制性受体并且随着耗竭程度的加深其表达的数量和种类也逐渐提高。同时，耗竭的CD8+T细胞逐步丧失自身的多种抗病毒功能，而最后严重耗竭的病毒特异性CD8+T细胞自身开始凋亡，数量逐渐减少。在慢性病毒感染过程中，更高的病毒载量、更持久的感染过程或者更少来自CD4+T细胞的帮助都会造成更严重的CD8+T细胞耗竭。而在人类的慢性病毒感染，如HIV，HBV，HCV和HTLV等感染中，同样发现了CD8+T细胞的耗竭和凋亡。
　　然而在慢性病毒感染过程中，耗竭的CD8+T细胞仍然具有部分效应功能，并且在一定程度上控制病毒的复制。最近的研究发现，在LCMV-Cl13小鼠感染模型的耗竭CD8+T细胞中存在一群CXCR5阳性的CD8+T细胞。这群细胞相较于其它CXCR5阴性的CD8+T细胞，其表面表达更少的起负调控作用的抑制性分子如PD-1、Tim3、2B4、Lag3等。在接受体外刺激后，CXCR5+ CD8+T细胞能够分泌更多的细胞因子和脱颗粒标志物CD107，而且有更多比例的细胞能同时分泌多种细胞因子。同时，这群细胞也表现出更强的细胞杀伤和控制病毒复制的能力，较高地表达与记忆细胞相关的表面分子CD127和CD62L，具有更强的增殖能力和类似造血干细胞一样的能力。因此，这群CXCR5+ CD8+T细胞可能在耗竭的T细胞中起主要的抗病毒的作用。而最近在包括LCMV、SIV、HIV等慢性病毒感染的多项研究中发现高表达CXCR5的病毒特异性的CD8+T细胞迁移进入淋巴组织B细胞滤泡的现象。并且这群CXCR5+ CD8+T细胞能够杀伤滤泡中被感染的TFH细胞，控制TFH细胞内的病毒复制，这一群细胞的发现为削减HIV病毒以及功能性治愈HIV感染提供了新的重要线索。
　　在急性和慢性病毒感染中，CD8+T细胞的分化或功能受到一系列分子通路和转录因子的调控，其中DNA结合抑制蛋白(ID蛋白)是急性病毒感染中调控CD8+T细胞分化的重要分子。在急性病毒感染中，Id3能够促进记忆性CD8+T细胞形成并通过增强调节DNA复制和修复相关的基因表达来维持其存活。此外Id2也参与调节CD8+T细胞的分化，并且与Id3的作用截然相反。而且Id2可能通过E2A来抑制性调节Id3的表达。而在LCMV慢性病毒感染中，E2A能够直接与Cxcr5基因的调控区结合并促进CD8+T细胞表面CXCR5的表达，Id2则可以抑制E2A与该基因的结合。敲除Id2或者过表达E2A均能够促进CXCR5阳性CD8+T细胞的生成，并增强CXCR5+ CD8+T细胞分泌细胞因子的能力和细胞杀伤能力。在LCMV-Docile慢性感染模型中，Id3+2B4-的病毒特异性CD8+T细胞也能够分化为Id3-2B4-或者Id3-2B4+的病毒特异性CD8+T细胞，而不能反向分化。而过表达Id3则能够抑制CD8+T细胞表面Fas的表达，减少来自Fas/FasL介导的细胞凋亡来维持CD8+T细胞的存活。因此急性病毒感染后Id3高表达的CD8+T细胞和慢性病毒感染中CXCR5+ CD8+T细胞在表型、功能和分化等多个方面均表现出高度的一致性。但是慢性病毒感染情况下CD8+T细胞内Id3与CXCR5表达之间的关系以及Id3对CXCR5+CD8+T细胞表型和功能的影响仍不清楚。
　　因此，我们对Id3在慢性病毒感染中对CXCR5阳性CD8+T细胞的表型和功能的调控作用进一步研究，本研究中的实验方法、实验结果和结论条列如下:
　　1.我们在普通B6小鼠感染LCMV-Cl13病毒后的第8，24和32天，取小鼠的脾细胞，经CD8+T细胞富集后通过抗体染色和流式细胞分选分别获得CXCR5+ CD8+T细胞和CXCR5-CD8+T细胞，抽取二者的总RNA并将其逆转录成cDNA，再通过RT-qPCR测量两群细胞中Id2和Id3的mRNA表达量。结果显示相较于CD44hi CXCR5-CD8+T细胞，CD44hi CXCR5+ CD8+T细胞中的Id3表达量在LCMV慢性感染后的三个时间点均较高，而Id2表达量较低。并且Id2和Id3在这两群细胞中的表达量在这段时间内保持稳定。
　　2.给予CD4Cre Id2flox/flox小鼠LCMV-Cl13病毒感染，并在耗竭期取脾脏细胞计数并行流式染色分析CD44hi CXCR5+和CD44hi CXCR5-CD8+T细胞的数量、表面抑制性分子的表达和分泌细胞因子的功能。结果表明，Id2-/-小鼠脾脏中CD44hi CXCR5+ CD8+T细胞占已被激活的CD8+T细胞的比例和数量均升高，而表面抑制性分子的表达量下降。经体外病毒肽刺激后，Id2条件敲除小鼠体内能够分泌细胞因子TNFα或表达脱颗粒标志物CD107a/b的CD8+T细胞数更多。同时Id2敲除小鼠较普通小鼠脾脏和肺脏中病毒滴度显著降低。
　　3.给予CD4Cre Id3flox撇小鼠LCMV-Cl13病毒感染，在耗竭期取脾脏细胞计数并行流式染色分析CD44hi CXCR5+和CD44hi CXCR5-CD8+T细胞的数量和功能。结果表明，两组小鼠中CD44hi CXCR5+ CD8+T细胞表面抑制性分子的表达量均较CXCR5-CD8+T细胞群为低。但是Id3条件敲除小鼠脾脏中CD44hi CXCR5+ CD8+T细胞占已被激活的CD8+T细胞的比例没有出现改变，而CD44hi CXCR5+和CD44hi CXCR5-CD8+T细胞的数量均增加，两群细胞表面抑制性分子的表达量均下降。经体外病毒肽刺激后，Id3条件敲除小鼠体内CD8+T细胞能够分泌更多的细胞因子TNFα并表达更多的脱颗粒标志物CD107a/b。同时通过RT-qPCR方法测量两组小鼠的组织内所含病毒滴度显示Id3敲除小鼠较普通小鼠脾脏和肺脏中病毒滴度显著降低近10倍。
　　4.我们构建了Id3过表达质粒，并最终将其转导进入P14细胞。然后将这些细胞注入受体小鼠体内并给予LCMV-Cl13感染。在感染后第8天我们测量了过表达Id3的P14细胞中CXCR5的表达以及分泌细胞因子的能力。结果显示，过表达Id3和对照组的P14细胞中CXCR5的表达量无显著差异，而Id3过表达也未显著改变整体CD8+T细胞的功能。
　　5.通过HIV患者淋巴结免疫荧光染色我们发现CD8+T细胞迁移进入B细胞淋巴滤泡。淋巴结细胞流式染色发现，CXCR5+CD8+T细胞表达较高的Id3并具有更强的效应功能。经过HIV特异性抗原肽体外刺激的PBMCs中，IFNγ+ CD8+T细胞即病毒特异性CD8+T细胞中，CD107a/b-细胞群和TNFα-细胞群内表达的Id3分别稍高于CD107a/b+细胞群和TNFα+细胞群。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 材料与方法

第三章 D蛋白在LCMV慢性病毒感染中CD8+T细胞内的表达

3．1 引言

3．2 结果

3．3 讨论

第四章 Id2在LCMV慢性病毒感染中对CXCR5+CD8+T细胞数量和功能的影响

4．1 引言

4．2 结果

4．3 讨论

第五章 Id3在LCMV慢性病毒感染中对CD8+T细胞数量和耗竭表型的影响

5．1 引言

5．2 结果

5．3 讨论

第六章 Id3在HIV感染中对CD8+T细胞表型及功能的调控

6．1 引言

6．2 实验结果

6．3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述 ID蛋白在感染情况下对T细胞的调节作用

攻读学位期间发表的论文

致谢