泛素连接酶Parkin在糖尿病肾病肾小管上皮细胞应激性衰老中的作用

摘要

目的：
　　糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病的主要并发症之一，是目前世界范围内导致终末期肾脏病及透析的首要病因。DN发病机制复杂，其中肾小管上皮细胞应激性衰老是导致DN发生发展的重要机制。研究证实，肾小管细胞衰老是DN病理损伤标志之一。衰老肾小管细胞能够产生大量促炎因子和促纤维化因子等衰老相关分泌表型，引起组织局部炎症反应和纤维化。同时抑制肾小管的加速衰老可延缓DN进展为终末期肾脏疾病。E3泛素连接酶Parkin在脑、心、肾等组织器官中均可广泛表达，其基因突变与老年性痴呆、帕金森病的发病密切相关。过表达Parkin能够延长果蝇寿限，提示Parkin可能是一个潜在的抗衰老因子，但目前Parkin与DN肾脏衰老关系尚不清楚。本研究旨在探讨Parkin在DN诱导的肾小管细胞应激性衰老中的作用，为DN的防治寻找新的有效靶点和理论依据。
　　方法：
　　1.临床病例
　　研究对象为2015年1月至2016年6月期间于我科就诊的2型糖尿病患者。行肾脏病理确诊为DN共40例。对照组来源于肾脏原发性肿瘤患者行切除术后远端正常肾组织，并行肾组织病理检查，共10例。收集两组基线临床数据，包括年龄、性别、身高、体重、体质指数、收缩压、舒张压。于肾活检或手术1天前收集患者血尿标本，-80℃超低温保存，测定其生化指标包括：血肌酐、血清尿素氮、血糖、糖化血红蛋白、血清胱抑C、血清白蛋白、血尿酸、血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、C反应蛋白、尿蛋白定量、尿N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶和估算肾小球滤过率。免疫组化检测糖尿病肾病患者肾组织Parkin的表达，显微镜下观察并计算Parkin阳性率，并与临床资料和病理损伤评分进行相关性分析。免疫荧光检测糖尿病肾病患者肾组织Parkin分别与衰老标志物p16、衰老相关分泌表型IL-6和TGF-β的关系。
　　2.体外实验
　　剪取3-4周龄的C57雄性鼠双肾皮质，经胶原酶孵育及双重筛网滤过后获得肾小管细胞。采用原代肾小管细胞专用培养基，常规培养两代后用于后续实验。通过30mmol/l高糖刺激肾小管细胞72h，并通过免疫荧光检测肾小管细胞p16、γ-H2AX的阳性率，WB检测p16和Parkin蛋白水平的变化，PCR检测Parkin mRNA水平的变化，ELISA检测细胞培养基上清中IL-6和TGF-β的分泌。进一步采用Parkin过表达腺病毒或Parkin siRNA转染肾小管细胞，检测Parkin上调或下调后高糖刺激的肾小管细胞p16、γ-H2AX的表达变化，及IL-6和TGF-β的分泌。
　　结果：
　　1.糖尿病肾病肾组织Parkin的表达变化及与肾小管细胞应激性衰老、肾间质损伤的关系
　　免疫组化显示，Parkin主要表达于肾小管上皮细胞。对照组肾小管细胞Parkin阳性率为43.5±6.0％，IFTA0分组肾小管细胞Parkin阳性率与对照组相近，为40.8±4.3％，IFTA1分组为32.8±4.8％，IFTA2分组为28.5±4.2％，IFTA3分组为19.0±4.9％，提示肾小管细胞Parkin的阳性率随着DN的进展逐渐降低。相关性分析显示Parkin的阳性率与肾小球硬化、肾小管萎缩与肾间质纤维化、肾间质炎症均呈显著负相关(P＜0.05)，与肾脏功能损伤指标，包括尿蛋白定量、尿NAG、尿素氮、血清胱抑素C、血肌酐和收缩压均呈负相关，与eGFR呈正相关(P＜0.05)。表明Parkin表达降低与DN肾结构和功能损伤水平均密切相关。进一步通过免疫荧光检测糖尿病肾病患者肾组织肾小管细胞Parkin分别与p16、IL-6及TGF-β的关系发现，与对照组相比，DN患者肾小管细胞衰老标志物p16、促炎性因子IL-6、促纤维化因子TGF-β的表达增多，与Parkin的表达趋势相反。
　　2.Parkin与DN肾小管上皮细胞应激性衰老的体外研究
　　2.1高糖诱导肾小管细胞应激性衰老
　　体外研究发现，与正常对照组相比，高糖组肾小管细胞p16和γ-H2AX的阳性率显著增大(P＜0.05);WB结果表明高糖组p16蛋白表达水平为对照组的2.13倍(P＜0.05);ELISA表明肾小管细胞IL-6、TGF-β的分泌显著增多(P＜0.05)，提示高糖环境可诱导肾小管细胞应激性衰老及IL-6、TGF-β的分泌。
　　2.2高糖刺激下肾小管细胞Parkin的表达变化
　　与对照组相比，高糖刺激后肾小管细胞Parkin的mRNA水平下降了60.8％，蛋白水平则下降了53.1％(P＜0.05)，与DN患者中Parkin表达逐渐减少的趋势相同，提示高糖可抑制肾小管细胞Parkin的表达。
　　2.3Parkin对高糖诱导的肾小管细胞应激性衰老的作用
　　Parkin过表达腺病毒转染上调Parkin的表达后发现，与高糖组比较，Parkin过表达后肾小管细胞p16和γ-H2AX的阳性率分别减少了32.1％和37.8％(P＜0.05)，WB提示该组p16蛋白水平减少了18.4％（P＜0.05，vs高糖组）;Parkin siRNA沉默Parkin发现，高糖刺激后，Parkin干扰组p16和γ-H2AX的阳性肾小管细胞比例较单纯高糖刺激组升高了24.5％和17.6％(P＜0.05);WB提示该组p16蛋白水平升高了21.0％（P＜0.05，vs高糖组），表明Parkin可抑制高糖诱导的肾小管细胞应激性衰老。进一步检测细胞培养基上清IL-6和TGF-β的分泌，发现高糖+Parkin siRNA组肾小管细胞IL-6和TGF-β的分泌较高糖组均显著增强，同时高糖+Parkin过表达组IL-6和TGF-β的分泌较高糖组显著减少(P＜0.05)，表明Parkin可抑制高糖诱导的肾小管细胞IL-6、TGF-β的分泌。
　　结论：
　　E3泛素连接酶Parkin的表达随着DN肾间质损伤的加重而逐渐减少，并与DN肾组织结构与功能损伤、肾小管细胞应激性衰老密切相关;Parkin可抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞应激性衰老和促炎促纤维化因子的分泌。

目录

声明

主要英文缩写一览表

摘要

前言

第一章 糖尿病肾病肾组织Parkin的表达变化及与肾小管细胞应激性衰老、肾间质损伤的关系

1．1 引言

1．2 材料与方法

1．3 结果

1．4 讨论

第二章 Parkin在糖尿病肾病肾小管细胞应激性衰老中的体外研究

2．1 引言

2．2 高糖诱导肾小管细胞应激性衰老

2．2．1 材料与方法

2．3．2 结果

2．3 高糖刺激下肾小管细胞Parkin的表达变化

2．3．1 材料与方法

2．3．2 结果

2．3 调控Parkin的表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞衰老的作用

2．3．1 材料与方法

2．3．2 结果

2．6 讨论

全文总结

参考文献

文献综述 肾小管上皮细胞应激性衰老致急性肾损伤修复不良的研究进展

攻读学位期间的研究成果

致谢