幽门螺杆菌表位特异性CD4+T细胞免疫保护机制及CD8+T细胞应答特征研究

摘要

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)为革兰阴性菌，螺旋杆状，感染后定植于人和多种动物胃粘膜局部，导致胃炎，胃十二指肠溃疡及胃癌等多种胃肠疾病。1994年，H.pylori已被世界卫生组织(WHO)列为一类致癌因子。目前H.pylori全球平均感染率超过50％。针对H.pylori感染病人，临床医生多采用联合多种抗生素及质子泵抑制剂进行治疗。然而，由于抗生素滥用，耐药菌株逐年增多，加之抗生素疗法成本较高，且伴有不良反应，寻求新的有效的治疗手段成为目前研究的重点。疫苗接种作为控制病原微生物感染的重要方式，有望成为预防和抵抗H.pylori感染及相关疾病发生的有效手段。
　　本课题在研究保护性CD4+T细胞应答类型及其保护机制过程中，发现H.pylori感染后可诱导CD8+T细胞应答。H.pylori为胞外感染菌，主要引起CD4+T细胞而非CD8+T细胞应答。但已有研究观察发现:H.pylori可有效侵袭并定植于树突细胞，胃上皮细胞，巨噬细胞等多种细胞内。另有研究报道表明，H.pylori感染猪后，粘膜局部可观察到明显的CD8+T细胞增殖反应。临床病人样本研究进一步证实H.pylori感染可诱导CD8+T细胞应答。然而对于H.pylori感染诱导的CD8+T细胞应答的免疫学特征及其进一步的作用机制尚不明确。
　　本课题中，我们选用保护性抗原UreB作为模式抗原免疫小鼠，建立保护性小鼠模型，体外扩增培养抗原特异性T细胞，并对抗原特异性Th1，Th2，Th17及抗体功能进行研究。同时筛选鉴定了UreB抗原中的优势Th表位，并评价了优势应答表位的免疫保护效果。探讨了表位特异性Th1应答免疫保护机制。为全面了解H.pylori感染后机体免疫应答特征，揭示H.pylori持续定植感染机制，我们对H.pylori感染后CD8+T细胞尤其是粘膜局部浸润的CD8+T细胞表型特征及特异性细胞因子分泌情况进行初步探讨。
　　目的:
　　1.阐释幽门螺杆菌感染后表位特异性CD4+T细胞免疫保护机制
　　通过UreB抗原免疫小鼠建立保护性小鼠模型，体外扩增抗原特异性CD4+T细胞，评价特异性T细胞在H.pylori感染中的免疫保护效果。通过筛选并鉴定UreB中的优势Th表位，确定其MHC限制性及自然递呈特性，评价优势应答表位的免疫保护效果，筛选可用于表位疫苗设计的候选表位，进一步探讨表位特异性CD4+T细胞免疫保护机制。
　　2.探讨幽门螺杆菌感染后CD8+T细胞免疫应答特征
　　通过建立H.pylori感染小鼠模型，明确感染后CD8+T细胞尤其是粘膜局部特异性CD8+T细胞应答类型，增殖特性，特异性细胞因子分泌等免疫应答特征，以全面了解H.pylori感染后机体免疫应答情况，并初步探讨H.pylori诱导CD8+T细胞应答的可能机制。
　　研究方法
　　1.幽门螺杆菌感染后表位特异性CD4+T细胞免疫保护机制研究
　　SPF级雌性BALB/c小鼠经UreB抗原联合弗氏佐剂行四肢皮下注射免疫，建立抗原保护性小鼠模型;3H掺入实验及RT-PCR检测UreB抗原免疫后小鼠特异性CD4+T细胞增殖及细胞因子分泌;抗原特异性CD4+T细胞体外扩增后经流式检测特异性细胞因子表达谱;利用合成系列重叠肽，筛选UreB抗原中的优势应答表位;MHC抗体特异性阻断细胞表面MHC分子，明确优势应答表位的MHC限制性;诱导骨髓源树突细胞(BM-DCs)，负载抗原后与表位特异性T细胞共培养，评价优势表位自然递呈特性;通过比较筛选表位与预测表位免疫应答能力，评价筛选表位优势应答特性;优势表位与CpG佐剂预混合后滴鼻免疫小鼠，行H.pylori灌胃感染，Real-time检测粘膜局部细菌定植量，评价优势应答表位免疫保护效果;通过表位特异性CD4+T细胞过继免疫实验及IL-17-/-小鼠，明确表位特异性CD4+T细胞免疫保护功能;通过检测表位特异性CD4+T细胞表面归巢受体及趋化因子受体，并结合粘膜局部CD4+T细胞浸润情况，初步探讨表位特异性CD4+T细胞免疫保护机制。
　　2.幽门螺杆菌感染后CD8+T细胞免疫应答特征
　　采用2×108 CFU H.pylori连续灌胃BALB/c小鼠，建立小鼠感染模型;通过EDTA，DTT处理感染后小鼠胃组织，提取粘膜局部浸润CD8+T细胞，流式检测H.pylori感染后粘膜CD8+T细胞的数量变化及表型特征;通过流式，CCK8及CFSE检测CD8+T细胞特异性增殖情况;通过UreB抗原体外刺激培养，扩增抗原特异性CD8+T细胞，明确H.pylori诱导CD8+T细胞应答中的交叉递呈途径;利用合成系列重叠肽，筛选UreB抗原中的优势应答表位;诱导骨髓源树突细胞(BM-DCs)，负载抗原后与表位特异性CD8+T细胞共培养，评价优势表位自然感染下交叉递呈特性;通过ICS及FCM对粘膜CD8+T细胞细胞因子，归巢受体及趋化因子进行检测。
　　结果
　　1.幽门螺杆菌感染后表位特异性CD4+T细胞免疫保护机制研究
　　1.1 UreB抗原免疫后诱导机体产生特异性Th1及Th17应答。从UreB抗原中筛选到两个优势T细胞表位，UreB317-329和UreB409-421。表位免疫后，可同时诱导产生强烈的Th1及Th17应答。
　　1.2 优势表位UreB317-329和UreB409-421可在自然状态下被抗原递呈细胞递呈至细胞表面。UreB409-421特异性Th1及Th17应答可被MHC-Ⅱ(I-A)抗体特异性阻断。UreB317-329特异性Th1应答可被MHC-Ⅱ(I-A)抗体阻断，而其特异性Th17应答可被MHC-Ⅱ(I-A)和MHC-Ⅱ(I-E)抗体所阻断。
　　1.3 表位UreB317-329和UreB409-421较已发表的预测表位UreB229-244，UreB237-251，UreB546-561可诱导更为强烈的Th1应答。且此两个表位难以通过生物学软件有效预测得到。
　　1.4 UreB317-329和UreB409-421免疫后可有效降低胃粘膜局部H.pylori定植量，并可降低局部炎症损伤程度。
　　1.5 UreB317-329和UreB409-421特异性T细胞TCRVb存在明显差异。同一表位特异性Th1及Th17细胞间Vb表达趋势一致。
　　1.6细胞表面归巢受体及趋化因子受体，L-selectin及α4β7参与Th1细胞抗H.pylori保护性免疫应答过程。
　　2.幽门螺杆菌感染后CD8+T细胞免疫应答特征
　　2.1 H.pylori感染后，胃粘膜局部CD8+T细胞数量明显增多，且与CD4+T细胞相比，粘膜局部CD8+T细胞增殖更为明显。
　　2.2 胃粘膜局部浸润的CD8+T细胞为经典CD8+T细胞类型。表面TCR分子为TCRαβ+，且较少观察到CD8αα+T细胞及γ8 T细胞。
　　2.3 H.pylori感染后，粘膜局部浸润的CD8+T细胞可针对H.pylori活菌及H.pylori超声上清抗原产生特异性增殖反应。
　　2.4 H.pylori感染后，粘膜局部CD8+T细胞分泌的主要细胞因子类型为IFN-γ及TNFα。
　　结论
　　1.本课题建立从抗原保护小鼠模型中扩增抗原特异性T细胞，并对抗原中优势应答表位进行筛选鉴定的方法。利用系统方法对UreB抗原中的优势应答表位进行了全面筛选及特性鉴定，并证实此方法得到的表位较预测法所得表位具有更强的免疫应答优势。鉴定得到两个具有良好免疫保护效果的优势应答表位，可用于后续表位疫苗的研发。本研究发现表位特异性Th1细胞介导了机体抗H.pylori的保护性免疫应答，Th17可能参与了H.pylori感染后的炎性损伤过程。归巢受体及趋化因子受体在表位特异性Th1细胞抗H.pylori免疫保护过程中发挥关键作用。课题所得结果将利于我们进一步了解机体抗H.pylori保护性免疫应答反应，促进相关疫苗的研发。
　　2.本课题证实H.pylori感染后除CD4+T细胞外同时可有效诱导粘膜局部CD8+T细胞应答。首次对H.pylori感染后胃粘膜局部浸润CD8+T细胞表型进行了系统的分析。研究证实细胞表面归巢受体及趋化因子受体在H.pylori感染后粘膜CD8+T细胞免疫应答过程中发挥关键作用。尽管对H.pylori诱导CD8+T细胞应答的机制尚不十分明确，但交叉递呈途径可能在其中扮演了重要的角色。课题所得结果将利于全面了解H.pylori感染后机体免疫应答特征。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 幽门螺杆菌表位特异性CD4+T细胞优势应答的保护机制研究

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 CD8+T细胞在幽门螺杆菌感染过程中的应答特征研究

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

3．5 小结

全文结论

本研究的创新、不足和展望

参考文献

文献综述 幽门螺杆菌疫苗研究现状

攻读博士期间研究成果

致谢