一株藏红花内生真菌多糖的结构及其抗肿瘤、免疫活性研究

摘要

真菌多糖作为天然活性生物大分子，在生物医药、日用化工等领域已经受到人们的广泛关注。藏红花在抗肿瘤，增强免疫力，降血脂，抗高血压，抗抑郁，抗炎等都很好的药理活性。已有研究表明藏红花多糖不仅对人子宫癌HeLa细胞有很强的细胞毒性，还能促进巨噬细胞的活性。但是藏红花是柱头入药，且栽培条件很难控制，因此产量很低，满足不了市场的需求。前期基础工作已经通过活性筛选发现藏红花内生真菌CSL-27多糖有很强的抗氧化活性和良好的抗肿瘤活性。因此本文系统地对该多糖的提取、分离、纯化及其结构片段、生物活性等进行研究。主要研究包括：
　　第一部分：利用响应面法结合星点设计考察藏红花内生真菌CSL-27多糖的醇沉提取工艺。首先进行单因素实验，以多糖得率为指标，分别对醇沉时间，醇沉温度，最终pH和液料比进行考察，得到醇沉时间16 h，醇沉温度4 ℃，最终pH7和液料比（95％乙醇与发酵液的体积比）为4:1(L/L)，以此条件为星点设计的中心点设置三个水平，再结合响应面法进行试验分析。得到最佳醇沉条件为醇沉时间16 h，醇沉温度3.7 ℃，最终pH7.2和液料比为5:1(L/L)并进行验证实验，多糖得率为162μg/L，与预测值165μg/L相近，说明该工艺能有效提高多糖的提取率，为多糖深入研究提供基础。
　　第二部分：运用柱层析分离纯化藏红花内生真菌CSL-27多糖以及化学结合仪器的方法研究多糖的理化性质和EPS-2的结构。藏红花内生真菌CSL-27多糖溶液，先经Sevag试剂脱蛋白，大孔树脂AB-8脱色，透析和冻干等步骤处理后，再用DEAE-52纤维素柱层析分离，得到两个多糖片段EPS-1和EPS-2，最后两个多糖片段再经葡聚糖凝胶G-75柱层析洗脱后曲线为单一对称峰。以葡萄糖标准品作标准曲线，苯酚硫酸法测得EPS-1和EPS-2的糖含量为46.60%和28.89%。高效液相色谱分析法测定EPS-1的单糖组成，含有甘露糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，对应的比例是2.3:1.0:1.1:1.4；EPS-2的单糖组成含有甘露糖、葡萄糖和阿拉伯糖，对应的比例是9.2:6.4:1.0。高效液相凝胶排阻色谱出峰分布均一，表明多糖EPS-1和EPS-2都为均一多糖，分子量分别为29409和40427。EPS-2的紫外光谱显示在260nm和280 nm处均无吸收峰，说明不含核酸和蛋白。红外光谱分析结果表明，EPS-2在3367cm-1,2939 cm-1,1131cm-1和1056cm-1处的吸收峰均是多糖的特征吸收峰，结构中可能含有β-D-吡喃环和α-糖苷键。扫描电镜显示 EPS-2表面凹凸不平，有大量褶皱及空隙存在，这些都说明 EPS-2结构的复杂。GC-MS分析得到四个不同类型的糖残基片段，分别为1→6)-β-D-葡萄糖、1→)-α-L-阿拉伯糖、1→2,4)-α-D-甘露糖和1→)-α-D-甘露糖，对应摩尔比例为6.25:1.00:4.47:6.32。最后结合核磁共振波谱确定片段的连接顺序，得到重复单元结构的主链由1→6)-β-D-葡萄糖，1→2,4)-α-D-甘露糖组成，支链由1→)-α-L-阿拉伯糖和1→)-α-D-甘露糖组成。
　　第三部分：利用MTT法体外评价多糖EPS-2的抗肿瘤活性和免疫活性。通过考察多糖EPS-2分别对人慢性髓原白血病K562细胞、人肺癌A549细胞、人早幼粒白血病HL-60细胞和宫颈癌HeLa细胞的抑制作用来评价其抗肿瘤活性。实验结果显示在剂量浓度(0~5 mg/mL)范围内，EPS-2对K562，HL-60和A549三株细胞的增殖无显著的抑制作用，而在0.5 mg/mL时对HeLa细胞的增殖就具有一定的抑制作用。与前期工作的藏红花内生真菌CSL-27多糖的抗肿瘤活性结果存在差异的原因，可能是多糖中的色素和EPS-1对其抗肿瘤活性也有一定的作用。巨噬细胞作为免疫效应细胞在免疫应答中发挥着重要作用，因此可通过研究多糖EPS-2对小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7的促增殖活性来评价EPS-2的免疫活性。实验结果表明在剂量浓度(0~5 mg/mL)范围内，EPS-2对小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7细胞都没有促增殖活性，免疫活性低，可能是EPS-2不与巨噬细胞RAW264.7表面的受体结合，不能促进炎症因子的分泌而无法发挥免疫活性。

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第一章 绪论

1.1 藏红花的概述

1.2 植物内生真菌多糖的概述

1.3 植物内生真菌多糖的研究现状

1.4 本研究的意义和主要内容

第二章 藏红花内生真菌CSL-27多糖醇沉工艺的研究

2.1 实验材料和仪器

2.2 实验方法

2.3 实验结果与分析

2.4 本章小结

第三章 藏红花内生真菌CSL-27多糖纯化及物理化学性质研究

3.1 实验材料和仪器

3.2 实验方法

3.3 实验结果与分析

3.4 本章小结

第四章 藏红花内生真菌多糖EPS-2的抗肿瘤和免疫活性研究

4.1 实验材料和仪器

4.2 实验方法

4.3 实验结果与分析

4.4 本章小结

第五章 结论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间已（或待）发表的论文

致谢