靶向EGFR二聚化界面单克隆抗体的体外抗肿瘤分析

摘要

目的：表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）是人表皮受体（Human epidermal receptor,HER；包含EGFR，HER2, HER3,HER4）家族的一员，在30％以上的上皮癌中过表达或异常活化，与肿瘤的发生和发展高度相关。EGFR阳性肿瘤患者常表现为预后差、转移快、对放疗和化疗抗拒和生存期短，因此EGFR是最热门的抗瘤药物靶点之一。靶向EGFR的药物主要有单克隆抗体和小分子酪氨酸激酶抑制剂二大类，但已上市药物临床反应率低（低于30%）并常诱导耐药，而这二种现象均与EGFR靶位点的变异及受体异源二聚化高度相关。二聚化是HER家族受体活化必须经历的途径，并且参与二聚体形成的界面区域是高度保守的区域，因此，我们提出了EGFR二聚化界面靶向策略，并制备了一种直接靶向EGFR二聚化界面区β环的单克隆抗体（Antidimer5G9），意图通过该类精准靶向抗体解决EGFR变异和异源二聚化而带来的临床反应率低和耐药问题。为了客观评价EGFR二聚化界面靶向策略的可行性，本研究主要考察了Antidimer5G9对不同HER过表达表型和不同二聚化模式肿瘤细胞的生长抑制与抗同源或异源二聚化的作用。
　　内容:
　　1.单克隆抗体Antidimer5G9制备与保存方法建立；
　　2.肿瘤细胞受体“过表达亚型”鉴定；
　　3.Antidimer5G9与肿瘤细胞表面EGFR特异性结合分析；
　　4.Antidimer5G9对不同受体“过表达亚型”肿瘤细胞的抑制活性分析；
　　5.抗二聚化分析
　　方法：
　　1.单克隆抗体Antidimer5G9制备与保存方法建立；
　　体内诱生法在BALB/c小鼠内获得大量的腹水型单抗，用辛酸硫酸法纯腹水单抗后，protein A柱精纯单抗，分子筛G25置换为PBS溶液（ph7.4,10mM）, BCA法测定单抗的浓度后加入终浓度10%的甘油及1:100加入酶抑制剂混合液，混匀，分装置于-80℃超低温冰箱。
　　2．肿瘤细胞受体“过表达亚型”鉴定
　　当细胞培养至80%丰度时，提取总蛋白。采用SDS-PAGE, Western Blot的方法测定它们EGFR, HER2,HER3的表达水平。即，各细胞株取同等量（20μg）蛋白样品按常规方法SDS-PAGE，湿法转膜，一抗分别采用鼠抗人EGFR、HER2或HER3抗体，二抗采用HRP标记的羊抗小鼠和羊抗兔抗体，化学发光法显色，设β-Actin做内标蛋白。
　　3.Antidimer5G9与肿瘤细胞表面EGFR特异性结合分析
　　选取EGFR过表达细胞株MDA-MB-231，将细胞按5x104个，接种于激光共聚焦皿中央，采用4%的多聚甲醛固定，1%BSA封闭，分别用Antidimer5G9及cetuximab作为一抗孵育后，相应的HRP标记的羊抗小鼠和羊抗人抗体作二抗孵育，上机分析。
　　4.Antidimer5G9对不同受体“过表达亚型”肿瘤细胞的抑制活性分析
　　采用MTT法检测单克隆抗体Antidimer5G9对EGFR：EGFR过表达细胞株人乳腺癌细胞MM231，EGR:HER2过表达细胞株人肺癌细胞H292，EGFR:HER2:HER3过表达细胞株人胰腺癌细胞BXPC-3以及EGFR正常表达的细胞株小鼠成纤维细胞3T3及EGFR阴性表达的细胞株MCF-7细胞增殖抑制；
　　5.抗二聚化分析
　　EGFR:EGFR、EGFR:HER2和EGFR:HER3等3种代表性模式细胞，采用化学交联剂DTSSP共价交联膜表面受体二聚体拍档。细胞在完全培养基中生长至80%丰度后，血清饥饿24h，按200μg/ml浓度加入抗体，保温1h，用5μg/ml EGF10min后用偶联剂DTSSP对细胞表面的二聚体原位化学偶联。Western blot方法分析EGFR同源或异源二聚体形成情况。一抗分别采用鼠抗人EGFR、羊抗兔HER2或HER3抗体。用SDS-PAGE, Western blot的检测方法比对研究Antidimer59G与西妥昔抗EGFR同源和异源二聚化作用的能力。
　　结果：
　　1.单抗Antidimer5G9的生物学特性
　　本实验前期用流式细胞细胞术分析结果表明，单抗Antidimer5G9可与MM231细胞表面的EGFR特异性的结合，诱导MM231细胞凋亡。本实验用激光共聚焦显微镜观察，FITC标记。结果显示，单抗Antidimer5G9可有效与细胞表面结合，且结合反应显示出明显的“剂量依赖性”。
　　2.受体“过表达亚型”鉴定
　　通过Western Blot实验结果表明，3T3细胞为EGFR，HER2，HER3弱表达，MM231和H292为EGFR中度表达，BXPC-3为EGFR高度表达；H292和BXPC-3为HER2高度表达，MM231为EGFR不表达；BXPC-3为HER3高度表达，而MM231和H292为HER3弱表达。
　　3.单抗Antidimer5G9对肿瘤细胞的生长抑制作用
　　经辛酸-硫酸铵法粗纯，protein A柱精纯的腹水单抗，纯度达到95%以上，体外抑制实验结果表明：Antidimer5G9对EGFR过表达的典型细胞株MDA-MB-231细胞有明显的抑制作用，抑制率高达62.24%，且呈现“剂量依赖型”，显示出了高于上市抗体“西妥昔”的抑瘤活性。对不同EGFR表型的细胞生长具有不同的抑制效应，对EGFR过表达的细胞株MM231抑制率最高，达到63.23%；对EGFR:HER2过表达细胞株H292及EGFR:HER2：HER3过表达细胞株BXPC-3的抑制率分别为58.76%和56.42%；而对EGFR正常表达细胞3T3细胞株及EGFR阴性表达细胞株MCF7未观察到显著的抑制作用（分别为4.83%，5.82%）。
　　4.比对分析单抗Antidimer5G9和CetuoximAb的抗二聚化能力
　　以化学交联剂DTSSP,共价交联膜上的参与二聚体形成的拍档受体，采用非还原SDS-PAGE, Western Blot方法分析。结果表明，单抗Antidimer5G9及西妥昔均能抑制MM231细胞EGFR同源二聚体的形成数量。单抗Antidimer5G9还可抑制BXPC-3的EGFR/HER2的异源二聚体的形成，而西妥昔单抗对异源二聚体无显著的抑制作用。
　　结论：
　　1.成功分离纯化得到了单克隆抗体Antidimer5G9，它可以特异性的结合于细胞表面的EGFR，并有效抑制EGFR恶性过表达细胞的增殖，抗体和细胞的结合反应和抑制效应高度相关。
　　2.通过western blot技术，鉴定本实验所用细胞的过表达亚型，MCF-7为EGFR阴性表达细胞，3T3细胞为EGFR正常表达的细胞，MDA-MB-231为EGFR过表达细胞，H292为EGFR，HER2过表达细胞，BXPC-3为EGFR,HER2，HER3过表达的细胞。
　　3.通过化学偶联剂DTSSP,成功共价交联膜上的形成二聚体的拍档受体，采用western blot技术检测了不同细胞的受体二聚化表型，其中MDA-MB-231为EGFR同源二聚体，BXPC-3为EGFR/HER2为异源二聚体。
　　4.单抗Antidimer5G9可抑制EGFR同源二聚体的形成，同时也可一定程度抑制EGFR异源二聚体的形成,其抑制效果高于cetuoximab。

目录

声明

第一章 序言

1.1 研究背景

1表皮生长因子家族与上皮癌

2靶向EGFR治疗恶性肿瘤的现状

3 靶向EGFR二聚化界面策略

1.2 研究目的、意义

1.3 研究内容

1.4 研究路线

第二章 单克隆抗体Antidimer5G9的生物活性分析

2.1 前言

2.2 实验材料

2.2.1 主要仪器设备

2.2.2 主要试剂

2.3 实验方法

2.3.1 溶液的配制

2.3.2 单抗Antidimer5G9的制备与纯化

2.3.3 肿瘤细胞受体“过表达亚型”鉴定

2.3.4 甘油对肿瘤细胞增殖的影响

2.3.5 MTT法测定生长抑制率

2.3.6 激光共聚焦观察分析抗体与细胞表面特异性结合

2.3.7 细胞表面受体二聚体原位化学偶联

2.3.8 抗二聚化分析

2.4 结果

2.4.1 单抗Antidimer5G9制备与保存方法的建立

2.4.2 肿瘤细胞受体“过表达亚型”鉴定

2.4.3 单抗Antidimer5G9与细胞表面EGFR的特异性结合

2.4.4 Antidimer5G9对不同受体过表达亚型肿瘤细胞的生长抑制作用

2.4.5 细胞表面受体二聚体原位化学偶联效果分析

2.4.6 Antidimer5G9抗受体同源/异源二聚化的作用

2.5 讨论

参考文献

附录一文献综述:不同抗体和表皮生长因子受体胞外域的相互作用研究进展

附录二 英文缩写词表

附录三攻读学位期间发表的论文专利及参加科研情况

致谢