具氢气缓释功能的中药复方多重智能响应纳米给药系统的构建与评价

摘要

噪声性聋是由噪声所诱发的听觉系统损伤，也是最常见的职业性伤害和听力致残因素之一。研究认为，噪声致聋的一个重要机制是耳蜗氧化应激产生了大量活性氧自由基，导致内耳毛细胞的破坏，进而影响了听觉的传输。另一方面，由于线粒体中氧化应激导致氧化呼吸链的中断，使得大量酸性中间代谢产物堆积造成局部酸化。随着中医药现代化的发展，传统中药复方制剂已无法适应中医精准医学的理念和发展，因此，亟待开发新型复方制剂释药系统，实现中药复方制剂现代化。丹参与三七配伍，是临床上常用的药对之一，二者中的活性成分均能够有效清除活性氧自由基，且均能起到预防和治疗噪声性聋的作用。自日本学者首次报道氢气的抗氧化效果以来，氢气对内耳疾病及内耳毛细胞的保护作用也得到广泛研究。目前有研究表明，氢气可减轻内耳毛细胞的氧化应激，对噪声性聋具有良好的防治作用。智能响应型释药系统以其精准化、个体化的独特优势，得到了世界范围内广泛关注及研究。相比于单一刺激响应性系统，针对多种刺激信号的多重响应性系统能够更为精确地控制药物的释放。本课题选择丹参、三七有效组分（丹参酮IIA、三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1）作为模型药物，针对噪声性聋所造成的氧化应激和局部酸化，设计了以pH响应性纳米碳酸钙（CMCS/CC）为药物载体、以低分子量壳聚糖（CS）为氧化响应性外壳并包载超顺磁性纳米四氧化三铁，集pH、氧化、磁响应性于一体的多重响应纳米给药系统；同时制备载纳米氢化钙的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸共聚物（mPEG-PLGA）纳米粒（NPs）以实现氢气的缓慢持续性释放。最后分子对接结果显示，二者可以通过氢键作用相结合，得到三重响应同时具氢气缓释能力的中药多组分复合纳米载药体系。
　　以碳酸钙（CC）为基质、羧甲基壳聚糖（CMCS）为生物矿化抑制剂，采用生物矿化法构建pH响应内核CMCS/CC。考察CMCS不同浓度对CMCS/CC粒径的影响，随着CMCS浓度的增加，CMCS/CC体系的平均粒径随之增加。X射线衍射分析表明，制备得到的CC主要晶型为方解石，平均粒径为39.7nm；扫描电子显微镜观察证实CMCS/CC为CC的聚集，且总体呈现类球形态；N2吸附脱附实验结果提示CMCS/CC存在37nm和100nm左右的单峰，表明CMCS/CC存在多级复孔结构，且通过荧光显微镜观察显示，CMCS/CC微球对于水溶性的罗丹明B和脂溶性的尼罗红，均具有很好的包载性能。尼罗红释放实验表明，CMCS/CC的pH响应性能与CMCS的浓度有关，CMCS浓度为1mg/mL时，不同pH条件下释药行为相似；当CMCS浓度增大到3mg/mL以上时，则表现为pH6.0条件下的释药速率最快。
　　通过离子交联法制备CS外壳，首先利用CMCS与CS的电荷吸引将CS吸附于CMCS/CC表面，再利用γ-聚谷氨酸（γ-PGA）的交联作用，使CS在CMCS/CC表面形成交联结构，以形成稳定的核壳结构，同时在CS外壳中包载超顺磁性纳米粒以实现载体磁靶向性，并在其表面配合铁离子，利用类Fenton反应增强载体的氧化响应性能。粒径分布显示，CS浓度在一定范围内时，粒径分布相比于CMCS/CC变得更加均一，PDI更小，当CS浓度为10mg/mL时，PDI可低至0.002±0.10(n=3)，说明γ-PGA对CS的交联作用，使得作为外壳的CS在CMCS/CC表面更加致密。在CS层包载了超顺磁性Fe3O4纳米粒后，磁滞回线结果提示CMCS/CC-CS表现出良好的磁响应性能。氧化响应性试验表明，CMCS/CC-CS在100mM H2O2（pH5.0和pH6.0）环境中，尼罗红在6h内即可释放完全；数学分析表明，100mM H2O2环境中，CMCS/CC-CS在pH5.0条件下，满足一级释放动力学过程；在pH6.0条件下，满足Ritger-peppas方程，n=1.33，为super case II转运，表明药物的释放与基质的压力、亲水性玻璃态聚合物的相转变或聚合物的解聚、溶蚀有关；在pH7.4条件下，满足Ritger-peppas方程，n=0.503，表明药物的释放同时受到扩散和溶蚀两种作用的控制，且药物的扩散占据主导作用。
　　应用高速机械剪切法制备得到纳米氢化钙，在20,000-30,000rpm的转速下高速搅拌1 h后纳米氢化钙平均粒径在166.4nm，PDI为0.268。氢气检测试液测定氢气浓度发现，纳米氢化钙可以在较长时间内维持较高的氢气浓度，在48h内的氢气浓度可稳定在2.4ppm以上，具有较长的释氢时程和较高的释氢浓度。采用单乳化溶剂挥发法制备包载纳米氢化钙的mPEG-PLGA NPs，粒径增大到460.2nm，PDI为0.229。扫描电子显微镜观察其表面纳米形态呈现规整的球形，且分散性好。
　　应用分子动力学模拟及分子对接，理论计算出CMCS/CC-CS与mPEG-PLGA NPs之间可以通过氢键作用相结合，扫描电子显微镜观察到结合形态呈“花生”型，并通过FT-IR、XPS等分析手段证实了氢键的存在。次级键破坏实验表明，CMCS/CC-CS与mPEG-PLGA NPs结合的主要驱动力为氢键作用和（或）疏水作用，静电力起辅助作用。结构稳定性实验表明，该纳米体系在人工内耳外淋巴液中24h内整体形态无明显变化，且豚鼠体内实验证实其能够穿过圆窗膜，且在内耳外淋巴中有分布，形态有略微变化，但双纳米球的结合形态仍然存在，表明“花生”型纳米体系能转运穿过内耳圆窗膜，并能保持形态完整。
　　采用共孵育方法制备了载复方丹参三七的纳米给药系统。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、和丹参酮 IIA的包封率分别为61.93％、63.96%、94.35%和82.41%。
　　综上，本文研究结果表明，所构建的中药多组分复合纳米载药系统，具有pH、氧化、磁三重响应性能及氢气缓释作用，并能够包载亲水及亲脂性药物；对噪声性聋的预防和治疗具有潜在的应用价值，有望成为新型智能响应型中药复方给药系统。

目录

声明

第一章 前言

1. 噪声性聋概述

2. 噪声性聋病理机制及其诊断与治疗

3. 智能响应型纳米给药系统简述

4. 氢气对内耳疾病的预防及治疗作用

5. 丹参三七复方组分剂型研究现状及其对内耳疾病的治疗作用

6. 分子动力学模拟概述

7. 本课题的研究内容及意义

第二章 CMCS/CC的制备、表征及pH响应性的考察

1仪器与材料

2实验方法

3结果与讨论

4 本章小结

第三章 CMCS/CC-CS的制备、表征及氧化响应性的考察

1 仪器与材料

2 实验方法

3 结果与讨论

4本章小结

第四章 包载纳米氢化钙的mPEG-PLGA 纳米粒的制备及评价

1仪器与材料

2实验方法

3结果与讨论

4 本章小结

第五章 CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA NPs的制备、表征及分子动力学计算

1仪器与材料

2实验方法

3 结果与讨论

4 本章小结

第六章 载复方丹参、三七有效组分CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA NPs的制备与表征

1 仪器与材料

2 实验方法

3 结果与讨论

4 本章小结

参考文献

英文缩写注释

攻读硕士期间发表的论文

致谢