三种因素对海水氨氧化细菌的影响及其系统发育分析与amoA基因的克隆表达

摘要

氨氧化细菌在氮循环中起着重要作用，但由于其本身特性的限制，在实际生产中的应用效果并不佳。利用基因重组技术构建硝化基因工程菌，强化硝化过程相关酶基因的表达及其产物的代谢活性和环境适应性，或许可以突破氨氧化细菌本身特性的局限。本文研究了盐度、pH、氨底物起始浓度三种影响因子对一株海水氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteriurn，AOB)N2005株硝化作用的影响，通过分子手段鉴定了N2005株的分类地位，并克隆表达了amoA全长基因和扩增了部分HAO基因，为构建硝化基因工程菌提供基础依据。用改良的方法培养细菌，通过定时检测产物浓度以确定硝化强度。结果发现菌株N2005的实验室培养最适生长盐度为10～30，最适pH为7.5～9.0，最佳氨起始浓度为10mM。菌株N2005是适合本地养殖环境的土著菌株。采用PCR技术得到1098bp的16S rRNA和491bp的amoA(ammoniamonooxygenase subunit A)基因片段，并进行测序。经NCBI-Blast软件将序列在GenBank数据库中进行同源性检索表明，16S rRNA和amoA基因片段与亚硝化单胞菌Nitrosomonas sp.NS20的相对应基因片段同源性分别为98.4％和96.7％。按Stephen等人的分类方法，即将海洋环境中所分离纯化的Nitrosomonas marina和Nitrosomonasaestuarii为代表的几株菌归纳成类群6b，菌株N2005与类群6b最为相似，为亚硝酸单胞菌属的海水菌株。利用序列同源性设计引物，采用PCR技术对氨氧化细菌的特异性amoA基因全长进行克隆，并测序，将全长831bp的amoA基因克隆到表达载体pET 32a中，在大肠杆菌BL21(DE3)中成功超量表达出带6×His接头的融合蛋白。用氨氮快速分析盒测定重组细菌在海水中的氨氧化活性，发现基因工程菌的氨分解能力并不明显，可见具有催化位点的amoA亚单位在重组菌里并没有催化活性。利用序列相似性设计引物，通过PCR扩增得到992 bp的HAO基因片段。亚硝酸单胞菌属HAO基因全长1713bp，现只扩得部分基因片段。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.硝化细菌的作用

1.1水体中氨氮的形成及其危害

1.2氨氮的中毒机理

1.3硝化细菌的作用

2.硝化细菌的分类

3.硝化细菌的特性

4.硝化细菌的作用机理及相关酶类

4.1硝化细菌的作用机理

4.2硝化作用的相关酶类

5.硝化细菌的衰老和死亡

6.影响硝化细菌生长的因子

7.硝化细菌的检测

7.1硝化细菌数量的MPN检测法

7.2分子生物学技术在硝化细菌检测中的应用

8.硝化细菌的应用

8.1硝化细菌菌剂的开发

8.2硝化细菌在水产养殖水处理中的应用

8.3硝化细菌在废水处理中的应用

9.本研究的目的意义

第二章 盐度、pH和氨起始浓度对氨氧化菌硝化作用的影响

1.材料与方法

1.1菌株

1.2培养基

1.3主要仪器

1.4方法

2.结果

2.1 NO2-N标准曲线

2.2盐度对氨氧化细菌硝化作用的影响

2.3 pH对氨氧化细菌硝化作用的影响

2.4氨起始浓度对氨氧化细菌硝化作用的影响

3.讨论

4.小结

第三章海水氨氧化细菌N2005的系统发育分析

1.材料方法

1.1材料

1.2方法

2.结果

2.1 16S rRNA基因片段的扩增

2.2 amoA基因片段的扩增及菌落克隆的快速PCR鉴定

2.3同源性比较

3.讨论

4小结

第四章amoA基因全长的克隆和表达

1.材料方法

1.1材料

1.2方法

2.结果

2.1 amoA基因全长的扩增

2.2菌落PCR筛选阳性克隆

2.3序列分析

2.4重组质粒酶切鉴定

2.5表达产物的鉴定

2.6表达产物活性的观察

3.讨论

第五章HAO基因片段的扩增

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果

2.1 HAO基因片段的扩增

2.2测序结果

2.3序列分析结果

3.讨论

结论

参考文献

致谢

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