盐胁迫下药物对水稻基因差异性表达的分析

摘要

从寡核苷酸基因芯片检测到的盐胁迫下诱抗剂处理的水稻R6的差异基因[1]中，选择部分上调或下调比率高的基因包括P450家族、MDR家族部分基因和某些转录因子进行研究。 在诱抗剂HI能够提高水稻R6耐盐能力[2]的基础上，本试验通过在盐胁迫下采用药物RFP、CsA、EM、Cim、VP和农药hymexazol、诱抗剂HI处理，研究R6幼苗的形态变化，并用半定量RT-PCR技术研究药物、诱抗剂HI、HI-药物处理对上述基因表达的影响，揭示这些基因在盐胁迫下的表达差异，探讨这些基因是否与R6幼苗的耐盐性有关，期望挖掘诱抗剂诱导耐盐的相关基因和揭示水稻耐盐的分子机制。主要结果如下： 1.不同处理的水稻R6在NaCl胁迫下的苗期形态表现与H2O对照相比，盐胁迫下用药物处理和HI预处理后，各种药物处理的R6的苗高和根长都受到一定程度的抑制。与NaCl对照相比，诱抗剂HI促进R6根伸长，幼苗比盐处理的稍高。与NaCl对照相比，EM、Cim抑制苗高和根长，RFP促进苗高抑制根长，H、CsA、VP促进根长且幼苗比盐处理稍高。与诱抗剂HI相比，HI-EM-S、HI-Cim-S、HI-VP-S和HI-RFP-S处理不同程度抑制了HI对R6根的诱导，HI-CsA-S处理抑制HI对R6根的诱导作用不明显。HI-CsA-S、HI-VP-S、HI-Cim-S、HI-RFP-S处理与单独用CsA、VP、Cim、RFP处理相比，根变粗、胚根增多、根长稍微增长，HI-EM-S处理与EM处理均抑制根长。HI-Cim-S和Cim-S-HI处理的苗高整体上相差不大，出现根长较短、苗高较矮、苗顶端白化等现象。 2.半定量RT-PCR检测的不同处理对R6目的基因表达的影响2.1NaCl胁迫对R6目的基因的影响与H2O对照相比，叶中NaCl胁迫特异诱导P7、P16、P17、P29、P64和P65；根中NaCl胁迫上调P8，下调P16，结果表明这些基因可能是R6的耐盐性基因。 2.2诱抗剂HI和恶霉灵处理对R6目的基因的影响与NaCl对照相比，诱抗剂HI处理叶中特异诱导P8、P28，上调P11、P16、P17、P32，下调P15、P29、P65；H处理根中特异诱导P28，上调P8、P11、P16、P31、P32、P64，下调P29；H处理叶中特异诱导P8、P28，上调P11、P16、P31、P32，下调P15、P27、P29、P65。 根中H处理时，除P31外，其它基因差异表现与基因芯片相吻合。根中H处理和叶中H、诱抗剂HI处理基因差异表现相当吻合。 P8、P11、P15、P16、P17、P28、P29、P32、P64、P65是根和叶中H和诱抗剂HI处理影响显著的基因。叶中H处理后P27的表达加强。诱抗剂HI处理时，P450家族的P8、P11、P15、P16、P17，PGP家族的P32、P64、P65以及转录因子的P28、P29表达差异明显。 2.3盐胁迫下不同药物处理对R6目的基因的影响与NaCl对照相比，各种药物单独处理对基因特异表达为：叶中CsA对P7、P65，EM对P65，Cim对P7、P15、P29、P65，RFP对P64，VP对P15、P28、P31、P64、P65及根中EM对P7的表达完全抑制；CsA对叶中P28、EM对根中P28、Cim对根中P15的表达特异诱导。各种药物单独处理对基因增强(上调或下调)表达为：叶中CsA下调P29，EM下调P7、P11、P29、P65而上调P16、P17，Cim下调P11、P16、P17，RFP上调P11、P16、P17、P19、P28、P31、P32，VP上调P8、P9、P11、P16、P18、P19、P32；根中EM下调P8、P11、P31，Cim下调P19、P29、P31、P64，RFP上调P9、P11、P16、P18、P29、P31、P32、P64、P65而下调P7，VP上调P9、P11、P16、P18、P29、P31、P32、P64、P65。 药物以及HI-药物处理影响显著的是：叶中CsA处理P8、Cim处理P28、RFP处理P15的表达被完全抑制；叶中CsA处理P16、EM处理P7、Cim处理P31、VP处理P7、P18的表达明显被抑制；根中VP处理P7的表达被明显抑制。 总体上，在根和叶中，Cim对目的基因的表达主要起抑制作用，RFP主要起诱导作用；VP在叶中有一定的抑制作用，但在根中主要起诱导作用；EM在叶和根中抑制一些基因的表达，但也诱导某些基因的表达；CsA在叶中抑制作用不明显，影响基因比较少。 2.4诱抗剂HI预处理后不同药物处理对R6目的基因的影响与诱抗剂HI处理相比，诱抗剂HI预处理后药物处理，在叶中整体趋势为显著上调的是P8、P11、P28、P32、P65，显著下调的是P27、P29；在根中为显著下调的是P9、P29、P65；另外，P65在根和叶中变化趋势相反。 诱抗剂HI的处理效果被药物显著影响的是：在根中，HI预处理后CsA和EM处理P17、P18、P28、P64，CsA、EM和Cim处理P11、P16、P31、P32的表达被抑制。而在叶中，HI预处理后CsA处理P8、P16、P17、P27、P29，EM处理P16、P19、P27、P29、P64，Cim处理P8、P16、P18、P29、P31，RFP处理P7、P8、P27，VP处理P7、P8、P27的表达被抑制；EM处理P15、Cim处理P64的表达被完全抑制。 诱抗剂HI预处理有效调节了药物处理对基因表达的影响，提高R6耐盐性，P450和PGP家族基因的诱导剂和抑制剂可能与诱抗剂HI相互作用，使基因表达发生变化，进而对R6耐盐性产生一定影响。 2.5诱抗剂HI预处理后药物处理与单独药物处理对R6目的基因的影响药物的处理效果被诱抗剂HI逆转的是：HI逆转Cim对叶P7、P11、P15、P17、P29、P65和根P18、P19、P27、P64的抑制，CsA对叶P7、P65的抑制，RFP对叶P64、P65的抑制和对P29、P31的诱导；VP对叶P15、P18、P28、P31、P32、P64、P65和根P7、P8、P11、P31的抑制以及对叶P27的诱导，EM对叶P11、根P7和P8的抑制。 作为诱抗剂的HI可以逆转抑制剂对基因表达的抑制，也可以增强诱导剂对基因表达的诱导，诱抗剂HI与药物可能存在着互作协同作用，调节基因表达，提高抗性，使植株得以生存或生长发育正常。 2.6西咪替丁和诱抗剂HI处理时序不同对R6目的基因的影响先用Cim预处理后用HI处理，叶中表达完全被抑制的是P15、P27、P65，在根中为P15、P19；叶中表达显著被抑制的是P7、P17、P19、P31，在根中为P9、P17、P18；叶中表达被增强的基因是P16，在根中为P11。 根和叶中Cim和HI处理顺序不同，受影响的基因主要是P450家族基因，可能是诱抗剂作为一种外源物先被P450代谢，其代谢物的活性诱导，有利于提高了水稻R6的耐盐性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词表

声明

1引言

1.1诱抗剂的状况

1.2植物耐盐相关基因研究进展

1.2.1水稻耐盐分子机制

1.2.2植物细胞色素P450酶系的研究进展

1.2.3植物MDR基因和PGP的研究进展

1.2.4细胞色素C

1.2.5细胞色素氧化酶亚基Ⅱ

1.2.6谷胱甘肽转移酶基因

1.2.7 F-box家族基因

1.2.8 GRAS家族基因

1.2.9纤维素合成酶基因

1.3半定量RT-PCR及其应用

小结

2材料和方法

2.1供试材料

2.2 CsA、VP、RFP、H处理R6幼苗最佳浓度筛选实验设计

2.3水稻处理方法

2.4实验试剂及主要仪器

2.5实验方法

2.5.1从基因芯片检测资料中选取的差异表达基因

2.5.2对目的基因设计并合成引物

2.5.3水稻DNA的提取并筛选引物

2.5.4水稻幼苗根和叶RNA的提取方法筛选

2.5.5水稻幼苗根和叶RNA的提取及检测

2.5.6目的基因半定量RT-PCR检测

3结果与分析

3.1 R6幼苗处理药物CsA、VP、RFP、H浓度筛选

3.2 NaCl胁迫下不同药物单独处理对R6苗期形态的影响

3.3 NaCl胁迫下HI预处理后不同药物处理对R6苗期形态的影响

3.4 NaCl胁迫下HI和Cim不同时序处理对R6苗期形态的影响

3.5 DNA提取及DNA上引物筛选结果

3.5.1 水稻 DNA提取结果

3.5.2 DNA引物筛选结果

3.5.3目的基因生物信息学分析结果

3.6 RNA提取方法筛选结果

3.7总RNA的质量鉴定

3.8目的基因半定量RT-PCR检测

3.8.1 DNA酶处理RNA结果

3.8.2使用阳性参照检测反转录的电泳结果

3.8.3 actin的PCR体系中Mg2+浓度优化

3.8.4 PCR阴性对照实验结果

3.8.5 cDNA上引物进一步筛选结果

3.8.6 P32和内参actin同管竞争扩增结果

3.8.7 actin调整根和叶中各个处理时cDNA的模板量结果

3.8.8目的基因指数期扩增循环次数筛选结果

3.9盐处理叶和根中目的基因半定量RT-PCR检测结果

3.10 HI、H处理叶和根中目的基因半定量RT-PCR检测结果

3.11药物单独处理叶中目的基因半定量RT-PCR检测结果

3.11.1 CsA处理叶中基因的RT-PCR结果

3.11.2 EM处理叶中基因的RT-PCR结果

3.11.3 Cim处理叶中基因的RT-PCR结果

3.11.4 RFP处理叶中基因的RT-PCR结果

3.11.5 VP处理叶中基因的RT-PCR结果

3.12 HI预处理后药物处理叶中基因半定量RT-PCR检测结果

3.12.1 HI预处理后CsA处理叶中基因的RT-PCR结果

3.12.2 m预处理后EM处理叶中基因的RT-PCR结果

3.12.3 HI预处理后Cim处理叶中基因的RT-PCR结果

3.12.4 HI预处理后RFP处理叶中基因的RT-PCR结果

3.12.5 HI预处理后VP处理叶中基因的RT-PCR结果

3.13 HI和Cim不同顺序处理叶中基因RT-PCR结果

3.14药物单独处理根中目的基因半定量RT-PCR检测结果

3.14.1 EM处理根中基因的RT-PCR结果

3.14.2 Cim处理根中基因的RT-PCR结果

3.14.3 RFP处理根中基因的RT-PCR结果

3.14.4 VP处理根中基因的RT-PCR结果

3.15 HI预处理后药物处理根中目的基因半定量RT-PCR检测结果

3.15.1 HI预处理后CsA处理根中基因的RT-PCR结果

3.15.2 HI预处理后EM处理根中基因的RT-PCR结果

3.15.3 HI预处理后Cim处理根中基因的RT-PCR结果

3.15.4 HI预处理后VP处理根中基因的RT-PCR结果

3.16 HI和Cim不同顺序处理根中基因RT-PCR结果

4讨论

4.1半定量RT-PCR检测方法的优化

4.2水稻处理的形态差异与耐盐性

4.3在盐胁迫中根和叶中目的基因的表达差异性

4.4 HI和恶霉灵处理对水稻根和叶中基因表达的影响

4.5不同药物处理对根和叶中P450家族基因表达的影响

4.6 HI预处理后药物处理对根和叶中PGP基因表达的影响

4.7不同处理对根和叶中转录因子基因表达的影响

4.8不同处理对根和叶中CesA的表达差异

4.9 HI和西咪替丁不同顺序处理对根和叶中目的基因表达的影响

4.10利福平处理对根和叶中目的基因的表达差异

4.11 HI-药物处理相比药物处理对根和叶中目的基因表达的影响

4.12 HI-药物处理相比HI处理对根和叶中目的基因表达的影响

4.13基因表达差异的深入研究

5结论

参考文献

致谢

附录

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