斑节对虾性腺差异表达基因的筛选、克隆及表达分析

摘要

斑节对虾为重要的经济养殖对虾品种，在养殖条件下，其难以完成性腺发育过程并自然产卵，通常需用眼柄去除手术进行人工催熟，而这种手术方法容易导致亲虾死亡、卵质量下降等弊端。目前尚无其它更好的催熟技术用于启动斑节对虾的性腺发育，对对虾繁育过程中性腺发育分子调控机制也不清楚，生产实践和自然科学探索都迫切需要对对虾繁殖分子调控机制有一个较深层次的了解。从分子水平认识对虾性腺发育的分子作用机制，探讨对虾性腺发育调控机制，发展新的催熟技术，已成为当前研究热点。而目前认识斑节对虾性腺发育的分子机制的首要任务为筛选和鉴定与性腺发育相关的基因。 本研究利用mRNA差异显示技术，选取池塘养殖250日龄的斑节对虾为研究对象，筛选其性腺差异表达基因。首先利用3条3'端锚定引物反转录斑节对虾性腺总RNA，将得到的6种反转录产物与8条随机引物配对，进行24组cDNA扩增反应，将获得的PCR产物进行6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、硝酸银显色，最终获得173条差异片段。随机选取其中44条片段回收，经克隆测序及荧光定量PCR验证，最终获得10条阳性差异表达片段，其中OA7-1、OA7-2、OG8-1、OG8-2、OC1-3、OC4-2、OC8在卵巢中表达量极显著(P<0.01)高于精巢，TG6-3、TG8在精巢中表达量极显著(P<0.01)高于卵巢，TC1为精巢特异表达片段。 利用已获得的阳性克隆片段与本人所在实验室已测序完成的斑节对虾混合组织cDNA文库中的EST序列进行比对分析，进行电子克隆，并结合5'RACE技术获得斑节对虾e1F3g(btseIF3g)、核糖体蛋白L3(btsRPL3)和L7(btsRPL7)的全长cDNA序列及一条精巢特异表达基因(btsTC1)的cDNA片段。 采用荧光定量PCR及RT-PCR方法分析了btseIF3g、btsTC1和TG6-3在250日龄的斑节对虾各组织中的表达特性。btseIF3g在卵巢组织中的高表达现象暗示了其可能参与斑节对虾卵巢发育；btsTC1只在精巢组织中表达，而在卵巢及雌、雄性个体的眼柄神经节、脑组织、肝胰腺、肌肉中均不表达，基因组DNA水平检测没有发现其存在雌、雄差异，这种表达特异性表明btsTC1可能为一条由转录水平调控参与精子发生及繁殖相关的重要基因；TG6-3在雌、雄眼柄神经节不表达，在雌性脑组织中不表达，而在雄性脑组织中表达及在性腺组织中高表达水平，表明TG6-3有可能为一个参与斑节对虾性腺发育调控的重要基因。这一研究结果为进一步阐明对虾性腺发育的分子调控机制提供了有价值的信息。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1文献综述

1.1.1对虾性别决定机制

1.1.2斑节对虾性腺发育相关及差异表达基因的研究进展

1.1.3差异表达基因的筛选方法

1.2本研究目的和意义

2斑节对虾性腺差异表达基因的筛选

2.1材料与试剂

2.1.1试验材料

2.1.2主要试剂及配制

2.1.3引物

2.1.4主要仪器及设备

2.1.5提取RNA的试验用品及处理

2.2试验方法

2.2.1总RNA的提取

2.2.2总RNA的DNase-I消化

2.2.3酚-氯仿抽提及乙醇沉淀无DNA的RNA

2.2.4总RNA质量鉴定

2.2.5反转录

2.2.6差异显示

2.2.7 6%尿素变性聚丙烯凝胶电泳

2.2.8差异片段回收及二次扩增

2.2.9差异片段的克隆及测序

2.2.10差异片段的验证

2.3实验结果

2.3.1总RNA质量

2.3.2差异显示

2.3.3差异片段回收及克隆测序

2.3.4差异片段的验证

2.3.5差异片段的比对分析

2.4讨论

3斑节对虾性腺差异表达基因的克隆

3.1材料与试剂

3.1.1试验材料

3.1.2试剂

3.1.3引物

3.1.4主要仪器设备

3.2试验方法

3.2.1 cDNA文库查找

3.2.2 5’RACE

3.2.3 cDNA序列分析

3.3实验结果

3.3.1 btseIF3g序列分析

3.3.2 btsRPL3序列分析

3.3.3 btsRPL7序列分析

3.3.4 btsTCl的克隆

3.4讨论

4斑节对虾性腺差异表达基因的组织表达特性研究

4.1材料与试剂

4.1.1试验材料

4.1.2试剂

4.1.3引物

4.1.4主要仪器设备

4.2试验方法

4.2.1 cDNA的获取

4.2.2 btselF3g组织表达分析

4.2.3 btsTCl及TG6-3的组织表达分析

4.2.4 btsTCl的DNA水平检测

4.3实验结果

4.3.1 btselF3g组织表达

4.3.2TG6-3组织表达

4.3.3 btsTCl组织表达

4.3.4 btsTCl的基因组DNA水平分析

4.4讨论

参考文献

致谢

作者简历

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