苦地胆内酯对嗜水气单胞菌感染斑马鱼的保护效果及其机理初探

摘要

苦地胆(Elephantopus scaber Linn.)是一种分布广泛、来源丰富的民间常用传统中草药。苦地胆内酯(E.scaber lactones，ESL)作为苦地胆的重要活性成分，对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、巴氏杆菌、蜡状芽孢杆菌等具有明显的体外抗菌作用；对供试细菌的体外抗菌作用机理主要是在细菌的对数生长期，破坏细菌细胞壁，改变细胞膜通透性，导致细胞组分丧失、蛋白质变性，释放出溶菌酶引起细菌自溶。然而，ESL是否对动物特别是水生动物的重要病原菌-嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，AH)具有体内抗感染效果，其抗感染机理如何，尚未见报道。本研究采集苦地胆，利用超声波辅助提取、加压硅胶柱层析等技术制备ESL，利用模式实验动物斑马鱼(Danio rerio)，进行ESL体内抗AH菌感染保护效果试验，并初步探索ESL体内抗感染的机理，以补充ESL体内抗感染研究的内容，为ESL成为中草药来源的抗菌饲料添加剂奠定理论与试验基础。主要研究结果如下：
　　1.采用超声波辅助提取、加压硅胶柱层析等技术能够制备到苦地胆种内酯、异苦地胆种内酯和去氧苦地胆内酯，以石油醚：氯仿：乙醚(3:5:2)为展开剂，薄层层析法(thin layer chromatography，TLC)法测得三者Rf值分别为0.364、0.316和0.161。
　　2.ESL对AH菌有显著的体外抑菌作用，对AH菌的MIC、MBC分别为12.5mg/ml、15.6mg/ml。
　　3.饲料中添加一定剂量的ESL能对AH菌感染斑马鱼形成保护作用，高剂量ESL组(0.8％、1.6％)保护效果显著优于低剂量ESL组(0.2％、0.4％)，与0.1％恩诺沙星的保护效果相当。
　　4.投喂ESL含量为0.8％和1.6％的饲料，能使斑马鱼在AH菌致病性胞外产物溶液中存活时间显著高于对照组，说明高剂量的ESL能增强斑马鱼抗AH菌致病性胞外产物的能力。
　　5.饲料中添加不同剂量的ESL对斑马鱼的头肾指数及脾脏指数没有影响。
　　6.饲料中添加0.8％和1.6％的ESL能够显著提高斑马鱼体表黏液、肝脏及鳃中溶菌酶的活性；添加0.4％的ESL能显著提高斑马鱼体表黏液中溶菌酶的活性。
　　7.饲料中添加0.8％、1.6％的ESL能够显著提高斑马鱼肝脏碱性磷酸酶活性。
　　8.饲料中添加1.6％的ESL能够显著提高斑马鱼鳃总超氧化物歧化酶活性。
　　9.饲料中添加0.8％的ESL能够显著提高斑马鱼鳃组织中IgM含量。
　　10.ESL能有效防控AH菌对斑马鱼感染的可能机理是：通过直接抑菌杀菌作用减＃AH菌的数量；通过增强斑马鱼抗AH菌致病性胞外产物的能力降低其对斑马鱼机体的危害；通过提高斑马鱼体内水解酶类如溶菌酶、碱性磷酸酶活性来杀灭AH菌；通过提高斑马鱼超氧化物歧化酶活性，以清除已完成杀伤病原功能的吞噬细胞内超氧化物自由基；通过提高斑马鱼组织中IgM含量，增强机体的体液免疫功能。