湛江海域潮间蟹耐受麻痹性贝毒机理的初步研究

摘要

麻痹性贝毒不仅存在于贝类，还广泛存在于鱼、虾、蟹等水产品中，严重威胁人类健康，然而值得注意的是，一些生物对麻痹性贝毒却似乎比较迟钝，其耐毒机理备受关注。本文在建立麻痹性贝毒高效液相色谱(HPLC)检测平台的基础上，全面分析了湛江海域钝齿短桨蟹、火红皱皮蟹和方形大额蟹等潮间蟹的毒性、对麻痹性贝毒的耐受性以及潮间蟹体液对麻痹性贝毒的毒性中和作用，对潮间蟹耐受麻痹性贝毒的机理进行了初步研究，旨在为揭示潮间蟹耐受麻痹性贝毒机制提供科学理论依据。
　　本文主要从以下几个方面进行了研究：
　　1.通过探讨柱后衍生反应条件和流动相条件对反应荧光强度和分离效果的影响，优化了麻痹性贝毒膝沟藻毒素的最佳HPLC检测条件。实验结果显示最佳柱后衍生反应条件：柱后衍生反应液为70 mM高碘酸与含有0.12 M氢氧化钾和0.75 M甲酸铵的20％甲酰胺溶液的混合液，调整pH值在7.3～7.5之间，流速为0.8 min/mL，柱后反应温度为50℃；最佳流动相条件为：甲醇浓度1％，庚烷磺酸钠浓度1.5 mM，磷酸缓冲液浓度10 mM，pH值7.3。
　　2.在对潮间蟹毒性分析的基础上，通过向潮间蟹体内注射贝毒溶液的方法探讨了潮间蟹对麻痹性贝毒的耐受性，并采用小鼠试验比较了潮间蟹体液对麻痹性贝毒的毒性中和效果。实验结果显示，约12％潮间蟹样品的毒性超出水产品麻痹性贝毒卫生标准(4 MU/g)，各种潮间蟹对麻痹性贝毒均有不同程度的耐受性，其体液具有良好的毒性中和作用。
　　3.以钝齿短桨蟹体液为研究对象，采用小鼠毒性试验，通过分析比较不同分子量范围体液组分、蛋白酶解以及不同来源的蛋白质对体液毒性中和效果的影响，揭示体液中起到毒性中和效果的功效成分。实验结果显示，相对于低分子组分，体液的高分子组分(≥10KDa)有明显的毒性中和作用，且经蛋白酶酶解后毒性中和效果消失，另外体液的毒性中和效果明显优于牛血清蛋白以及牛奶等不同来源的蛋白质。
　　4.以麻痹性贝毒作亲和配体，采用亲和层析的方法比较了 AF-Epoxy-650M等树脂对体液中毒素结合蛋白的分离效果。实验结果显示，AF-Epoxy-650M亲和树脂的分离效果最佳，分离获得了电泳纯的贝毒结合蛋白，SDS-PGAE电泳结果显示该蛋白由7个分子量不等的亚基组成。
　　5.采用HPLC检测法，对贝毒结合蛋白与PSP毒素的结合效果进行了分析，结果显示该结合蛋白对所分析的GTXs、STXs、CTXs表现出不同的结合率，其中对neoSTX、dcSTX、STX的结合率较高，分别为72.27％、69.20％、56.92％；其次为GTX4，1，2，3，依次为61.45％，60.56％，33.56％，29.789/0；而对CTX1和CTX2的结合率较低，分别为14.22％和15.04％。