大豆肽的制备及其对小鼠免疫功能的影响

摘要

本研究旨在通过自然环境中筛选出适合豆粕液体发酵的菌株，通过响应面分析法优化大豆肽液体发酵工艺，提高蛋白质水解度，增加发酵液中低分子多肽的含量，开拓一条低成本大豆肽生产工艺路线。
　　从湛江自然环境、生长的植物和动物肠道内容物中采集样品98份，用平板透明圈法进行初筛，从中分离出117株产蛋白酶的芽孢杆菌，其中有11株的透明图与菌落直径比值(H/C)大于5.0；用Folin酚法测定11株芽孢杆菌发酵液的蛋白酶活力，筛选出菌株y-6产蛋白酶的能力最强，48 h发酵液中的蛋白酶活力达2852 IU/mL；通过形态染色特性观察、生理生化试验和16S rDNA基因序列分析，鉴定菌株y-6为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，暂命名为解淀粉芽孢杆菌y-6(Bacillusamyloliquefaciens strainy-6)。
　　将解淀粉芽孢杆菌y-6按4％接种GYP培养基，32℃、180 r/min振荡发酵6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h和48 h，4000 r/min离心20 min，取上清液，既为待测粗酶液；对粗酶液进行蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、果胶酶等酶活力测定；结果表明：48 h的发酵液中蛋白酶活力为1072.3 IU/mL，淀粉酶活力为3.75 IU/mL，纤维素酶活力为8.35 IU/mL，甘露聚糖酶活力为565.9 IU/mL，无明显的果胶酶活性。对发酵液中蛋白酶的酶学性质进行了研究，结果显示该蛋白酶为中性蛋白酶，在pH7～7.5有最高的酶活力，最适作用温度为55℃，40℃以下有较好的温度稳定性；该酶不耐受酸性环境，pH5以下易失活，pH3环境下保存1 h检测不出酶活力；Ca2+、Zn2+及吐温80对该酶有一定的激活作用，Mn2+、Fe3+、Cu2+及EDTA对酶有一定的抑制作用。
　　采用Minitab15.1版软件安排试验设计及试验结果统计分析，对解淀粉芽孢杆菌y-6发酵低温豆粕制备大豆肽的工艺进行了研究；采用Plaekett-Burman试验设计对pH值、接种量、摇床转速、温度、装液量共5个因素的主效应及交互作用进行考察，确定了接种量、温度、摇床转速三个重要影响因素；利用Box-Behnken中心组合设计出15个试验的响应面分析试验，对接种量、温度、摇床转速三个因素做进一步的参数选择优化；优化后的参数为：接种量6.3％，发酵温度为39.89℃，摇床转速为187r/min，优化参数后所得试验结果与回归模型预测吻合较好，说明所建立的回归模型是可靠的，可以较准确地预测出大豆肽转化率；优化发酵参数后，大豆肽的转化率由最初的63.7％提高到78.15％。
　　将120只小鼠随机分成三批，每批四组，每组10只；对照组饲喂基础日粮，三个试验组分别在基础日粮中添加1％、2％、4％的自制大豆肽，饲喂小鼠21 d后，测定免疫器官指数、血清溶菌酶、巨噬细胞吞噬功能和血清溶血素；结果表明：大豆肽可以显著提高小鼠免疫器官指数，增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性，激发小鼠抗鸡红细胞抗体的产生，而血清溶菌酶活性则无明显差异。
　　用高产蛋白酶的芽孢杆菌发酵低温豆粕制备大豆肽是完全可行的，所获得的大豆肽含量高，对小鼠免疫功能有增强作用。