枯草芽孢杆菌与鼠李糖乳杆菌融合子制备及其对三黄鸡免疫功能及肠道菌群的影响

摘要

枯草芽孢杆菌具有产生芽孢和消化酶的性能，鼠李糖乳杆菌具有产生乳酸和乳酸菌素的性能，二种菌均为益生菌，但各有优缺点。本研究以枯草芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌为亲本菌株，制备出原生质体后进行融合，以获得兼具两亲本优良性状的融合子，并进行动物试验，探讨其对三黄鸡免疫功能及肠道菌群的影响。
　　将两株菌分别接种于枯草芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌活化培养基中，36℃培养至对数生长中期，添加适量的青霉素和甘氨酸，继续培养至对数生长末期；将培养物离心，收集菌体细胞，用不同浓度的溶菌酶处理，测定原生质体的形成率；将两株菌的原生质体接种于再生培养基，37℃培养24 h，测定原生质体的再生率。结果表明，两株菌培养时，甘氨酸添加量为4 mg/mL，作用时间2 h；枯草芽孢杆菌培养时，青霉素添加量为6 U/mL，作用时间2 h；鼠李糖乳杆菌培养时，青霉素添加量为4 U/mL，作用时间2 h；当溶菌酶浓度为2 mg/mL、酶解温度为37℃、酶解时间为30 min时，枯草芽孢杆菌的原生质体形成率和再生率最高，分别为63.1％和56.0%、91.2%和88.5%、78.3%和91.2%，当溶菌酶溶液pH值为7.5时，枯草芽孢杆菌的原生质体形成率最高，为92.3%；而溶菌酶浓度为4 mg/mL、酶解温度为37℃、酶解时间为60 min时，鼠李糖乳杆菌的原生质体形成率和再生率最高，分别为83.2%和53.7%、89.2%和85.3%、71.5%和85.3%，当溶菌酶溶液pH值为7.0，鼠李糖乳杆菌的原生质体形成率最高为89.4%。
　　选用聚乙二醇（PEG）和新生磷酸钙溶液作为融合剂，在不同条件下融合枯草芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌原生质体。结果表明，同时添加聚乙二醇和新生磷酸钙溶液，可以促进两个原生质体的融合；用聚乙二醇融合时，在添加浓度为40%、pH值为7.0、37℃作用20 min的条件下可以得到最高的融合率。
　　将融合菌株（融合子）接种于四种再生培养基上，选用不同的培养基成分、pH值、培养方式及保存时间对融合子的再生条件进行优化。结果表明，适宜于融合子再生的培养基组分是：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、酵母膏5.0 g、NaCl5.0 g、葡萄糖10.0 g、蔗糖171.2 g、水解酪蛋白0.1 g、MgCl21.9 g、CaCl21.7 g、琼脂15 g，pH值调至6.5，采用双层培养基培养法，融合子保存时间越短越好。
　　通过融合子的再生试验共获得48株再生菌株，经过形态学观察及产酸性能分析，初步筛选出9株目标菌株；进一步对目标菌株的芽孢产生率、耐高温能力、产酸稳定性及遗传稳定性进行测定，最终筛选出目标菌株RH-3为理想融合子，其芽孢产生率为69.1%；经80℃高温处理后，在培养基上生长的菌落数为2.7×105 CFU/mL；经7代发酵培养，其pH值平均为4.47；经7代传代培养，其在培养基上的菌落数平均为18.4个。
　　选用96只1日龄三黄鸡，随机分为4组，每组设3个重复，每重复8只雏鸡；在试验组三黄鸡的饮水中添加RH-3融合子培养物，添加量为0.5%、1.0%和1.5%；试验期6周；试验鸡每个重复取2只，于21、42日龄采血和剖杀，取样品测定免疫指标和肠道内容物菌群数量。结果表明，RH-3融合子可以显著提高三黄鸡血清新城疫HI抗体效价，显著提高血清过氧化物歧化酶活性，显著提高淋巴细胞转化率和免疫器官指数，显著降低三黄鸡空肠、回肠和盲肠的沙门菌和大肠埃希菌的菌群数量，显著增加双歧杆菌和乳酸菌的菌群数量。
　　本研究制备出了枯草芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌融合子，具有提高三黄鸡免疫功能和肠道有益菌数量的作用。

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1文献综述

1.1 研究目的和意义

1.2 原生质体融合的概念及方法

1.3 原生质融合技术在微生物育种中的应用

1.4 枯草芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌功能特性研究

1.5 本研究的内容及拟解决的问题

2 枯草芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌原生质体的制备

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

3 枯草芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌原生质体的融合

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

4 枯草芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌融合子的再生

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

5 融合菌株的筛选与检测

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

6 亲本菌株和RH-3融合子胞外代谢产物GC/MS分析

6.1 材料与方法

6.2 结果与分析

6.3 讨论

7 RH-3融合子对三黄鸡免疫功能及肠道菌群的影响

7.1 材料与方法

7.2 结果与分析

7.3 讨论

8 结论

参考文献

致谢

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