红笛鲷TRAF3基因的克隆、表达及功能研究

摘要

红笛鲷是我国南方重要的海水经济养殖鱼类之一，近年来多种疾病的发生，对红笛鲷养殖业造成了巨大的危害，目前对于病原感染时红笛鲷的免疫机制及其免疫信号的转导过程还缺少深入的了解。TRAFs是在多个物种中都高度保守的一类信号接头蛋白，能够介导多种生物学效应。其中TRAF3是最具多样化的成员之一，能够与胞内多种受体如TNFR、NLR、TLR/IL-1R等相互作用，进而介导多条免疫信号通路的转导，因此TRAF3在细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡和免疫反应等多种生理过程中都有重要作用。为了研究TRAF3在红笛鲷免疫信号通路中的功能，本研究对红笛鲷TRAF3进行了克隆及功能分析，取得了以下研究成果:
　　1.利用RACE技术获得了红笛鲷TRAF3(Ls-TRAF3)基因全长，生物信息学分析表明，Ls-TRAF3序列的5'非编码区(5'-UTR)为253 bp，3'非编码区(3'-UTR)为1119bp，完整开放阅读框(ORF)为1788bp，可以编码595个氨基酸，蛋白预测分子量(MW)为67.44KDa，理论等电点(pI)为7.5。经蛋白结构域分析发现Ls-TRAF3含有1个环指结构，2个锌指结构，coiled-coil和该家族保守的MATH结构域。同源性搜索结果显示Ls-TRAF3与斑马宫丽鱼、尼罗罗非鱼、柏氏朴丽鱼和虹鳟的同源性较高，分别为92％、91％、91％以及79％，系统进化分析显示:红笛鲷TRAF3与红鳍东方纯(Takifugu rubripes)的亲缘关系较近。
　　2.Ls-TRAF3在红笛鲷各组织中广泛分布，且在脾、头肾和肝脏中的表达量相对较高。LPS和poly I∶C刺激后，红笛鲷头肾淋巴细胞中Ls-TRAF3的表达显著上调，且Ls-IL-6在LPS刺激后的表达变化趋势与TRAF3的表达呈负相关，而poly I∶C孵育后，Ls-IRF3、Ls-Mx的表达与Ls-TRAF3的表达则呈正相关，表明Ls-TRAF3参与了宿主抗病免疫效应，并且在不同免疫信号通路可能发挥着不同的作用。酵母双杂交结果表明Ls-TRAF3和Ls-CD40的胞内段存在相互作用，且进一步的荧光素酶报告基因实验结果显示，过表达Ls-TRAF3能显著抑制NF-κB活性，且Zinc finger1、Zincfinger2和coiled-coil结构域缺失后，依然能够显著抑制NF-κB活性，而RING和MATH缺失后，该抑制作用则明显减弱，表明RING和MATH结构域是Ls-TRAF3行使功能的关键结构域。
　　以上结果表明，Ls-TRAF3在红笛鲷抗病免疫信号通路中发挥了重要作用。本研究为揭示鱼类TRAF3的功能奠定了基础，也为进一步了解鱼类免疫信号通路提供了新的方向。

目录

声明

摘要

1 文献综述

1．1 红笛鲷的研究现状

1．2 红笛鲷免疫相关基因的研究进展

1．3 鱼类的免疫应答机制

1．3．1 先天性免疫

1．3．2 适应性免疫

1．4 TRAFs蛋白家族

1．5．TRAF3的简介

1．6 TRAF3在免疫信号通路中的作用机制

1．6．1 TRAF3在TNF-R超家族信号中的作用

1．6．2 TRAF3在TLRs信号中的作用

1．6．3 TRAF3在NLR信号中的作用

1．6．4 TRAF3在RLR信号中的作用

1．6．5 TRAF3在细胞因子受体信号中的作用

1．6．6 TARF3在水生动物中的研究进展

1．7 本研究的目的和意义

2 红笛鲷TRAF3基因的克隆及生物信息学分析

2．1 实验材料

2．1．1 试验用鱼

2．1．2 质粒载体与受体菌株

2．1．3 培养基的配制

2．1．4 其他溶液和试剂

2．1．5 试剂盒

2．1．6 生物信息学分析所用软件及网站

2．2 实验方法

2．2．1 红笛鲷组织样品的采集

2．2．2 总RNA提取

2．2．3 引物设计

2．2．4 Ls-TRAF3全长的扩增

2．3 结果与分析

2．3．1 Ls-TRAF3全长的扩增结果

2．3．2 Ls-TRAF3的序列分析

2．3．3 Ls-TRAF3氨基酸同源性及系统进化分析

2．4 讨论

3 Ls-TRAF3在红笛鲷中的表达差异分析

3．1 实验试剂

3．2 实验方法

3．2．1 免疫原的制备

3．2．2 实验材料

3．2．3 总RNA的提取及DNaseI消化

3．2．4 cDNA一链的合成

3．2．5 引物设计

3．2．6 Quantitiative Real-Time PCR(qRT-PCR)

3．2．7 数据统计及分析

3．3 实验结果

3．3．1 健康红笛鲷体内TRAF3基因的组织表达差异

3．3．2 红笛鲷TRAF3基因在病原刺激条件下的表达模式分析

3．3．3 红笛鲷TRAF3和相关基因在白细胞中的表达模式分析

3．4 讨论

4 酵母双杂交验证Ls-TRAF3蛋白和Ls-CD40蛋白的相互作用

4．1 实验材料

4．1．1 载体和表达菌株

4．1．2 试剂

4．2 实验方法

4．2．1 重组载体的构建

4．2．2 重组质粒的转化和其毒性检测

4．3 实验结果

4．3．1 重组酵母表达载体的鉴定

4．3．2 重组质粒的毒性及自激活性检测

4．3．3 Ls-TRAF3和Ls-CD40互作情况的检测

4．4 讨论

5 Ls-TRAF3对NF-κB信号的影响

5．1 实验材料

5．1．1 质粒载体真核表达质粒

5．1．2 试剂盒

5．1．3 其他实验材料

5．2 实验方法

5．2．1 引物设计

5．2．2 PCR扩增与重组质粒的构建

5．2．3 去内毒素质粒的提取

5．2．4 NF-κB报告基因的活性检测

5．3 实验结果

5．3．1 PCR扩增与重组质粒构建

5．3．2 过表达Ls-TRAF3对NF-κB信号的影响

5．3．3 TRAF3的各结构域对NF-κB信号的影响

5．4 讨论

6 结论

参考文献

附录

致谢

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