马氏珠母贝珍珠层基质蛋白基因的克隆与功能研究

摘要

本文在实验室前期研究基础上，以本课题组马氏珠母贝基质蛋白全谱为基础，并以在珍珠囊和中央膜转录组数据库中高表达为依据，筛选出可能与珍珠层形成相关的6个基因:4个没有功能注释的新基因和2个有丝氨酸蛋白酶抑制剂功能注释的基因。通过RACE和基因克隆技术获得这些基因的全长，对其序列的结构特征进行分析，通过Real-time PCR技术对各个基因进行组织差异表达分析，RNA干扰结合Real-time PCR及扫描电子显微镜(SEM)观察等技术对其在珍珠层形成中的功能进行初步分析，原位杂交技术研究基因的表达定位，进一步采用原核表达技术获得重组蛋白并通过western blot技术进行验证，为确认珍珠层形成相关的矿化基因与蛋白的对应关系，揭示珍珠层的分子调控机制研究提供依据。
　　1.四个没有功能注释的新基因按已有命名规则分别命名为:精氨酸丰富基质蛋白(Argnine-rich matrix protein，Pm-RRMP)、甘氨酸丰富基质蛋白（Glycine-rich matrix，Pm-GRMP）、脯氨酸丰富基质蛋白(Proline-rich matrixprotein，Pm-PRMP)、丝氨酸丰富基质蛋白（Serine-rich matrix protein，Pm-SRMP），cDNA全长分别为1063bp、2088bp、2312bp、3154bp，分别编码273、565、589和958个氨基酸，均为具有信号肽执行胞外功能的分泌蛋白。同样，利用Real-time PCR技术进行基因组织差异表达分析发现除了Pm-RRMP，另外3个基因的mRNA都主要在外套膜中央区及珍珠囊中呈现高表达，可能参与珍珠层的矿化过程，而Pm-RRMP在边缘膜中呈现高表达可能与贝壳棱柱层形成相关。RNA干扰后目的基因在外套膜中央区的表达量显著下降，结合SEM观察贝壳内表面的超微结构发现，珍珠层结构排列不规则，片层之间界限模糊，有融合的趋势，说明这4个基因在贝壳形成过程中起着重要作用。另外原位杂交研究还发现马氏珠母贝Pm-PRMP基因的mRNA表达定位于外套膜的外表皮，进一步证明它与珍珠层形成相关。
　　2.两个有丝氨酸蛋白酶抑制剂功能注释的基因分别命名为Pm-NSPI-1、Pm-NSPI-2，cDNA全长分别为766 bp和702 bp，分别编码164和183个氨基酸，预测分析均具有信号肽，说明两者均为分泌蛋白。成熟肽中都存在2个串联的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因家族结构域，根据这些特有的序列特征，我们初步确定本实验所克隆的2条序列均为马氏珠母贝Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员。利用Real-time PCR技术进行基因的组织差异表达分析发现，这2个基因都主要在外套膜中央区及珍珠囊组织中高表达;RNA干扰后发现目的基因在中央膜的表达量显著下降，SEM观察发现干扰后珍珠层结晶体表面粗糙，排列错乱，六边形结构不明显;运用原位杂交技术进行组织定位，研究发现Pm-NSPI-2基因的mRNA特异性地表达于外套膜的外表皮，这些研究结果均可表明筛选出的有丝氨酸蛋白酶抑制剂功能注释的目的基因均在珍珠层的形成中发挥重要作用。通过构建Pm-NSPI-1和Pm-NSPI-2的原核表达重组质粒，在大肠杆菌中进行优化表达，发现Pm-NSPI-1重组蛋白在IPTG浓度为0.1mM，诱导时间为12h，诱导温度为37℃时为其蛋白诱导的最佳条件;而相应地Pm-NSPI-2在IPTG浓度为0.8mM，诱导时间为8h，诱导温度为37℃时为其蛋白诱导的最佳条件，两者均以包涵体的形式存在。利用Westem blotting技术检测发现:优化诱导表达的重组蛋白能够与带有His标签的单克隆抗体进行免疫结合，显色反应后可以呈现出与重组蛋白预测分子量大小一致的条带，表明目的蛋白已被成功诱导表达。

目录

声明

摘要

1 文献综述

1．1 生物矿化

1．2 贝壳组成和结构的相关研究

1．3 贝壳基质蛋白概述

1．3．1 贝壳基质蛋白的分类

1．3．2 贝壳基质蛋白的特点

1．4 贝壳基质蛋白的研究进展

1．4．1 基质蛋白对CaCO3结晶型态的控制

1．4．2 珍珠囊矿化基质蛋白的研究

1．5 软体动物丝氨酸蛋白酶抑制剂研究进展

1．6 研究目的和意义

2 马氏珠母贝珍珠层基质蛋白新基因的克隆与功能研究

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物与材料

2．1．2 主要试剂和耗材

2．1．3 主要溶液和试剂的配制

2．1．4 主要仪器

2．1．5 引物信息

2．2 实验方法

2．2．1 总RNA的提取

2．2．2 cDNA第一链的合成

2．2．3 基因片段的克隆

2．2．4 目的基因RACE片段扩增

2．2．5 生物信息学分析

2．2．6 组织差异表达分析

2．2．7 RNAi实验

2．2．8 原位杂交实验

2．3 实验结果

2．3．1 马氏珠母贝珍珠层基质蛋白新基因的序列特征分析

2．3．2 马氏珠母贝珍珠层基质蛋白新基因的生物信息学分析

2．3．3 马氏珠母贝珍珠囊高表达新基因的组织差异表达分析

2．3．4 RNA干扰实验结果分析

2．3．5 原位杂交实验结果分析

2．4 分析与讨论

3 马氏珠母贝PmNSPIs基因的克隆及功能研究

3．1 实验材料

3．1．1 实验动物与材料

3．1．2 主要试剂和耗材

3．1．3 主要溶液和试剂的配制

3．1．4 主要仪器

3．1．5 引物信息

3．2 实验方法

3．2．1 总RNA的提取

3．2．2 cDNA第一链的合成

3．2．3 基因片段的克隆

3．2．4 马氏珠母贝PmNSPIs基因的RACE片段扩增

3．2．5 马氏珠母贝PmNSPIs基因的生物信息学分析

3．2．6 组织差异表达分析

3．2．7 RNAi实验

3．2．8 原位杂交实验(ISH)

3．2．9 马氏珠母贝PmNSPIs基因的原核表达研究

3．2．10 Western blotting实验

3．3 实验结果

3．3．1 马氏珠母贝PmNSPIs基因的基本特征

3．3．2 马氏珠母贝PmNSPIs基因的生物信息学分析

3．3．3 马氏珠母贝PmNSPIs基因的组织差异表达分析

3．3．4 RNAi实验结果分析

3．3．5 原位杂交实验

3．3．6 原核表达实验

3．3．7 Western blotting分析

3．4 分析与讨论

4 结论

参考文献

附录

致谢

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