卵形鲳鲹PPA Rα及CPTI基因的克隆及不同条件对其表达影响的分析

摘要

本文以卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）为研究对象，开展了对其脂肪代谢相关的两个基因PPARα和CPTⅠ cDNA全长的克隆，组织表达以及三种不同条件对其表达的影响等研究工作，结果如下:
　　1、PPARα和CPTⅠ基因cDNA全长的克隆与分析
　　采用RACE-PCR克隆了卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptors-α，PPARαt)基因和肉碱棕榈酰基转移酶Ⅰ(carnitine palmitoyltransferaseⅠ，CPTⅠ)两个基因的cDNA序列全长，并对序列及其编码的蛋白质进行生物信息学分析。结果表明:卵形鲳鲹PPARα基因(GenBank登录号KP893147) cDNA全长1930bp，开放阅读框(ORF)为1425bp，编码474个氨基酸，其编码的蛋白质为不稳定蛋白，无信号肽和跨膜结构，预测显示该蛋白有PPARs基因家族典型的DNA结合区(DBD)和配体结合区(LB D);卵形鲳鲹CPTⅠ基因（GenBank登录号KP987456）cDNA序列全长2841 bp，其开放阅读框(ORF)为2363 bp，编码787个氨基酸，3'非编码区(URT)335 bp，5'非编码区142 bp;生物信息预测显示CPTⅠ基因编码的蛋白无信号肽序列，脂溶指数高达85.63，GRAVY为-0.213，具有2个跨膜区螺旋;蛋白系统进化树分析显示，在人(Homo sapiens)、鼠（Mus musculus）、鸭（Gallus gallus）、花鲈、大黄鱼、军曹鱼等动物中，卵形鲳鲹的PPARα蛋白与军曹鱼的进化关系最为密切(94％)，与人(68％)、鼠(68％)、鸭(67％)等的同源性较低卵形鲳鲹CPTⅠ蛋白与花鲈(Lateolabrax japonicas)的同源性最高，达94％，大黄鱼(Larimichthys crocea)、金头鲷(Sparus aurata)的次之，均为93％，与人(Homo sapiens)、鼠(Mus musculus)等的同源性较低(65％)。
　　2、PPARα和CPTⅠ mRNA的组织表达分析
　　采用Real-time PCR技术，以β-actin为内参基因，对自然水体中养殖的健康卵形鲳鲹的PPARα和CPTⅠ两基因进行组织差异表达分析。结果表明，PPARα和CPTⅠ基因在心脏、肝脏、脑、鳃、脾脏、肠等10个组织均有表达，并且在一些脂肪代谢活跃组织中表达量较高。PPARα基因在脑脂肪组织、头肾、肠、脾脏等脂肪含量丰富的组织中表达量较高(P＜0.05)，CPTⅠ基因在肝脏组织中表达量显著高于其他组织(P＜0.05)，肌肉、心脏、脑等组织中表达量也较高。
　　3、非诺贝特对PPARα和CPTⅠ基因表达的影响分析
　　对卵形鲳鲹腹腔注射激动剂非诺贝特，并采用RT-PCR检测肝脏、肌肉中PPARα和CPTⅠ基因的表达变化趋势，研究激动剂对卵形鲳鲹PPARα和CPTⅠ基因表达的影响。结果显示，在非诺贝特浓度组中，50mg/kg的浓度下，PPARα基因的表达量显著高于其他组（P＜0.05），而CPTⅠ在20mg/kg的浓度下有较高的表达水平(P＜0.05);非诺贝特时间组中，PPARα基因随着时间的变化，其相对表达量呈现先降低后升高恢复到初始水平的趋势，CPTⅠ的相对表达量随时间变化是先升高后降低，后又升高的变化趋势，肝脏组织中，CPTⅠ的相对表达量在注射后30h表达量达到最高(P＜0.05），而在肌肉组织中18h时达到最高值（P＜0.05）。实验中PBS对照组PPARα和CPTⅠ基因的表达量均无显著性差异(P＞0.05)，且非诺贝特实验组PPARα和CPTⅠ基因的表达量均高于PBS对照组，即非诺贝特可诱导PPARα基因的表达，但CPTⅠ与PPARα基因表达并没有较明显的变化趋势相关性。
　　4、不同温度对PPARα及CPTⅠ基因表达的影响分析
　　将卵形鲳鲹分别置于16℃、19℃、22℃、25℃和28℃的温度中进行温度刺激，并采用RT-PCR检测肝脏、肌肉组织中两基因的表达情况。结果表明，将卵形鲳鲹从暂养水体直接放入16℃、19℃、22℃、25℃的控温水槽中时，PPARα和CPTⅠ基因表达量随时间都有上调趋势，其中，16℃和19℃时，无论在肝脏还是肌肉组织中，两基因表达上调显著(P＜0.05)，并都在12h时达到最大，随后又降落回初始值;与之相比，22℃和25℃时，两基因也有上调趋势，但不显著(P＞0.05），其中CPTⅠ基因在各时间点呈现缓慢的起伏变化，并在48h时低于初始值。
　　5、饥饿对PPARα及CPTⅠ基因表达的影响分析
　　对卵形鲳鲹进行短期饥饿胁迫，利用实时荧光定量来检测饥饿条件下卵形鲳鲹肌肉和肝脏中PPARα和CPTⅠ的表达情况，为探讨两基因的功能、作用机理以及调控鱼类脂肪沉积的研究提供参考资料和理论依据，同时为开展鱼类饥饿生理的研究在学术和应用上发挥着重要价值。本研究结果显示，PPARα和CPTⅠmRNA在肌肉组织中的表达量随时间的变化是先降低后升高，在达到32～48h处到达一个最大值后又降低，在肝脏组织中，两基因随时间先升高后降低。另外，饥饿组CPTⅠ基因的表达量普遍高于正常投喂的对照组，而PPARα基因表达量只有在最大值时超过对照组，其他时间点都低于对照组，这可能与这两基因的主要功能有很大关系，CPTⅠ基因与脂肪转化为能量直接相关，在饥饿条件下要将脂肪转化为维持鱼体新陈代谢和生命活动所需的能量，所以表达量比正常条件下更高。

目录

声明

摘要

1 文献综述

1．1 脂肪代谢相关基因的研究进展

1．1．1 PPARs基因

1．1．2 CPTI基因

1．1．3 其他脂代谢相关基因

1．1．4 前景与展望

1．2 PPARα配体的研究进展

1．3 温度对鱼类基因表达调控的研究进展

1．4 饥饿胁迫对鱼类基因表达的研究进展

1．5 卵形鲳鲹的概况

1．6 本研究的目的与意义

2 卵形鲳鲹PPARα及CPTI基因的克隆及生物信息学分析

2．1 PPARα基因的克隆及生物信息学分析

2．1．1 引言

2．1．2 实验材料与方法

2．1．3 结果与分析

2．1．4 讨论

2．2 CPTI基因的克隆及生物信息学分析

2．2．1 引言

2．2．2 实验材料与方法

2．2．3 结果与分析

2．2．4 讨论

3 卵形鲳鲹PPARα及CPTI基因mRNA的组织差异性表达分析

3．1 引言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 实验用鱼

3．2．2 实验试剂和仪器

3．2．3 实验方法

3．3 结果与分析

3．3．1 PPARα基因的组织差异性表达

3．3．2 CPTI基因的组织差异性表达

3．4 讨论

4 不同条件对卯形鲳鲹PPARα及CPTI基因表达的影响

4．1 非诺贝特对PPARα及CPTI基因表达的影响

4．1．1 引言

4．1．2 材料与方法

4．1．3 结果与分析

4．1．4 讨论

4．2 不同温度对PPARα及CPTI基因表达的影响

4．2．1 引言

4．2．2 材料与方法

4．2．3 结果与分析

4．2．4 讨论

4．3 饥饿对PPARα及CPTI基因表达的影响

4．3．1 引言

4．3．2 材料与方法

4．3．3 结果与分析

4．3．4 讨论

5 结论

5．1 卵形鲳鲹PPARα基因的克隆

5．2 卵形鲳鲹CPTI基因的克隆

5．3 卵形鲳鲹PPARα和CPTI基因的组织表达分析

5．4 非诺贝特对卵形鲳鲹PPARα和CPTI基因表达的影响

5．5 不同温度对PPARα及CPTI基因表达的影响

5．6 饥饿对卵形鲳鲹PPARα和CPTI基因表达的影响

参考文献

致谢

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