蓝光对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌杀灭作用的实验研究

摘要

研究背景及目的：
　　耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant staphylococcus aureus， MRSA）感染是引起创伤病人创面不愈、甚至死亡的重要原因，且 MRSA具有高度耐药性，临床抗MRSA治疗面临重大挑战。抗生素的使用是MRSA出现的最主要因素，尤其是抗生素的滥用。目前，针对 MRSA的治疗，临床指南推荐恰当抗生素、恰当剂量、早期治疗。抗生素使用必不可少，但却容易引起MRSA更大程度耐药，很多国家报道 MRSA对万古霉素出现不同程度耐药，甚至完全耐药。20世纪70年代，Costerton等提出了细菌生物膜（bacterial biofilm,BF）的概念并指出许多细菌以生物膜形式广泛存在于自然界中。细菌生物膜是细菌的重要生存方式，是细菌耐药性形成的重要机制之一。在世界范围内，中国是MRSA检出率较高的国家。因此开发新的MRSA治疗策略迫在眉睫。其中蓝光辐照技术抗菌疗法是近几年出现的最具有前景的治疗方法之一。本实验旨在通过体外及在体实验研究蓝光以不同能量作用于 MRSA及其生物膜，并观察分析其抗菌效果，为临床创伤病人 MRSA感染治疗提供有力工具，并可给其他耐药菌感染蓝光治疗提供新的研究思路。
　　研究方法：
　　本实验主要通过以下三个方面研究蓝光对MRSA的杀灭作用：
　　1．蓝光抗游离状态MRSA的实验研究：
　　本实验所选 MRSA菌株采集于上海交通大学医学院附属上海第三人民医院烧伤整形科，采用法国生物梅里埃公司ATB细菌鉴定仪鉴定。采用12 J/cm2、60 J/cm2、120 J/cm2、240 J/cm2的蓝光照射细菌，分别与非处理组（对照组）及红光照射组相比较；将照射后细菌分别采用平板划线、菌落计数、活/死（LIVE/DEAD）菌染色法评价蓝光杀菌效果。
　　2.蓝光抗生物膜内MRSA的实验研究：
　　挑取上述菌株，于盖玻片上完成 MRSA生物膜的培养。根据游离菌结果提示，选用120J/cm2、240J/cm2和360J/cm2蓝光进行照射，杀菌效果的评价：1.采用活/死（LIVE/DEAD）菌染色，并于激光共聚焦显微镜下观察；2.电镜下观察细菌死亡及生物膜破坏情况。
　　3.蓝光抗创面MRSA感染的实验研究：
　　动物实验我们选用具有生物发光功能的MRSA（ATCC33591）菌株。48只C57BL/6小鼠分对照组和干扰组，全部制作背部皮肤全层缺损创伤模型，大小为2 cm*2cm，于筋膜下注射菌量1*1010 CFU。对照组不予任何处理，干扰组采用120 J/cm2蓝光分别于伤后第0~7天进行照射。通过Fusion FX7图像扫描分析系统分析蓝光抗菌效果；皮肤病理切片苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosinstaining HE染色）了解干扰组及对照组炎性细胞浸润情况；用图像分析软件计算不同时相点的创面愈合率。
　　研究结果：
　　1.蓝光抗游离状态MRSA的实验研究：与对照组及红光照射组相比，60 J/cm2及以上剂量组蓝光照射具有明显杀菌效果（P均<0.01），呈剂量效应关系；红光照射组与对照组相比无明显差异，无杀菌作用。
　　2.蓝光抗生物膜内MRSA的实验研究：240 J/cm2能量密度的蓝光亦能有效杀灭MRSA生物膜内的细菌，破坏生物膜的形成。
　　3.蓝光抗创面MRSA感染的实验研究：与对照组相比，经蓝光连续6.0±0.9天照射后，实验组小鼠创面感染得到有效控制，大部分MRSA被杀灭；皮肤HE切片显示，在伤后早期两组炎性细胞浸润情况无明显差别，随着干扰组创面感染逐渐受到控制，炎性细胞浸润和对照组相比降低，伤后七天最为明显；同样，创面感染受到控制后，干扰组小鼠创面的愈合加快，愈合率增加。
　　结论：
　　蓝光能有效杀灭游离及生物膜状态的MRSA，并破坏生物膜的形成，其杀菌效果具有剂量效应关系；蓝光能有效控制小鼠创面MRSA感染，促进创面愈合。

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前言

主要仪器设备及试剂

第一部分：蓝光抗游离状态MRSA的实验研究

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

4 结论

第二部分：蓝光抗生物膜内MRSA的实验研究

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

4 结论

第三部分：蓝光抗创面MRSA感染的实验研究

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

4 结论

思考与展望

参考文献

致谢

附录A:综述:蓝光在基础及临床医学上的研究进展

硕士期间已发表文章