肾上腺髓质素N端20肽对血管紧张素Ⅱ剌激心肌成纤维细胞增殖、一氧化氮及胶原合成的影响

摘要

一.实验背景心肌重构是很多心血管系统疾病发展演变的共同环节，因此研究心肌重构的发生发展规律具有极其重要的意义。实验证实：心肌重构时，心肌成纤维细胞(cardiacfibroblasts，CFs)自身增殖及合成胶原显著增多，从而导致了心肌间质异常增多。近年来的研究表明，CFs能合成一氧化氮(nitrogenoxide，NO)，而NO具有抑制CFs的增殖、胶原合成的功能，在心肌重构方面有重要的作用与意义。 血流动力学改变、癌基因异常表达、心肌细胞凋亡、粘附因子以及体液因素等均是心肌重构的重要因素，其中血管活性多肽的作用尤为重要。血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)系统中极为重要的中间产物，它间接通过影响体循环血流动力学及血容量，以及直接促心肌肥厚和CFs增殖效应引起心肌重构。AngⅡ受体中主要有AT1和AT2两个亚型，目前认为AT1受体介导心肌细胞生长、肥大、纤维增生；而AT2受体介导心肌细胞调亡，二者有着密切的关系。因此，在探索心肌重构的机制及治疗方案时，AngⅡ一直是研究的热点。 肾上腺髓质素(adrenomedullin，ADM)是Kitamura等从手术切除的人肾上腺嗜铬细胞瘤提取物中发现的一种新的生物活性肽，人ADM的cDNA片段己克隆，共1293bp，翻译区可编码185个氨基酸，此185个氨基酸即肾上腺髓质素前体，是进一步合成肾上腺髓质原和终产物ADM的前体，它在内源性肽酶的作用下裂解为5个片段：(1)信号肽；(2)proADM22-41，肾上腺髓质素N端20肽(preadrenomedullin-N-20peptide，PAMP)；(3)proADM45-92；(4)pro-ADM95-146，成熟ADM；(5)proADM153-185又称为肾上腺升压素(Adrenotensin，ADT)。PAMP与ADM的部分生物学效应相同，但对PAMP研究的较少，特别是PAMP对心肌重构影响鲜有报道。Lippton等给麻醉鼠注射大剂量PAMP后，发现其能降低体循环动脉压和外周阻力，而且在发挥降压作用同时，也有增加心率与交感神经兴奋性的作用。动物实验观察到自发性高血压大鼠心脏和主动脉组织的PAMP浓度较正常血压大鼠增高；因此本实验以CFs为研究对象，观察AngⅡ、PAMP对CFs增殖、胶原合成与NO合成的影响。 二.目的本实验以体外原代培养SD新生大鼠的心肌成纤维细胞为研究对象，并加入不同浓度的AngⅡ、PAMP进行干预，通过观察CFs的增殖、合成胶原与NO的情况，来了解PAMP对心肌成纤维细胞的作用。初步探讨PAMP在心肌重构中的作用及意义。 三.实验方法采用胰酶消化、差速贴壁培养法，获得新生SD大鼠的原代CFs，本实验使用第3代。经免疫组化法鉴定，纯度为98％；台盼蓝染色细胞活力大于98％。实验分组为：①空白对照组；②10-9、10-8、10-7、10-6mol/LAngⅡ组；③10-9、10-8、10-7、10-6mol/LPAMP组；④10-7mol/LAngⅡ+PAMP(1019、10-8、10-7、10-6mol/L)组。每个浓度设6孔。 将CFs制成细胞悬液后按5000个/孔接种于三个96孔板中，使其生长接近融合时，加入含0.5％胎牛血清的DMEM继续培养24h，使细胞进入生长静止期。之后按实验分组设计加入药物继续培养。 MTT比色法检测心肌成纤维细胞的增殖。药物干预72小时后，每孔加入MTT20μl，继续培养4h；弃去各孔内上清液，并加入150μl二甲基亚砜，振荡混匀10分钟使结晶充分溶解。在酶联免疫检测仪上490nm波长处测定光吸收值(A490值)。 采用3H脯氨酸掺入法测定心肌成纤维细胞的胶原合成。药物培养44小时后，每孔加入3H脯氨酸2μCi和维生素C50μg，4小时后用0.125％胰蛋白酶消化细胞呈细胞悬液，把各孔细胞悬液吸出后依次置入不同的EP管，50000转/秒离心20分种后，用PBS冲洗2次。移入闪烁计数管中，每管加入闪烁液0.2ml，液态闪烁计数仪测定放射性强度。 用硝酸还原法测定NO的含量：加入药物培养24小时后，将各孔培养液吸入测定管中。具体操作过程按试剂盒说明进行。 四.结果1.AngⅡ对CFs增殖、胶原及NO合成的影响AngⅡ对CFs增殖的影响：浓度为10-9、10-8、10-7、10-6mol/LAngⅡ作用72h后，MTT比色A490值分别为1.0613±0.0042、1.2413±0.0037、1.4600±0.0033、1.6607±0.0037，各组与对照组(0.9513±0.0046)相比，有显著性差异(P均＜0.01)。表明AngⅡ可刺激CFs增殖。 AngⅡ对CFs胶原合成的影响：浓度为10-9、10-8、10-7和10-6mol/LAngⅡ组的3H脯氨酸掺入率分别为1487.45±22.72、1581.96±28.42、1939.82±51.94、2599.02±81.27dpm，显著高于对照组(1400.35±45.75dpm)。 AngⅡ对CFs的NO合成功能的影响：浓度为10-9、10-8、10-7、10-6μmol/LAngⅡ组细胞培养液中NO的浓度是：73.88±2.23、64.34±3.02、54.12±2.82、40.21±1.45μmol/L。各组之间有显著性差异(P＜0.05)。但空白组与10-9μmol/LAngⅡ之间无显著性差异(P＞0.05)。表明AngⅡ可抑制CFs合成NO。 2.PAMP对CFs的增殖、胶原及NO合成功能的作用PAMP对CFs增殖的影响：浓度为10-9、10-8、10-7、10-6mol/LPAMP作用72h后，MTT比色A490值分别为0.9512±0.0053、0.9525±0.0039、0.9510±0.0036、0.9508±0.0057，与对照组(0.9513±0.0046)相比，随着PAMP浓度的增高，MTT比色A490值无显著性差异(P均＞0.05)。表明随着PAMP对CFs的增殖无影响。 PAMP对CFs胶原合成的影响：10-9、10-8、10-7和10-6mol/LPAMP组的3H脯氨酸掺入率分别为1405.36±44.42、1403.39±35.49、1433.49±49.56、1419.36±43.05dpm，与对照组(1400.35±45.75dpm)相比(P均＞0.05)，各组之间无显著性差异。表明PAMP对CFs合成胶原无影响。 3.PAMP与AngⅡ共同作用于CFs时，CFs增殖、胶原及NO合成的变化PAMP与AngⅡ共同作用时，CFS增殖的变化：浓度为10-9、10-8、10-7、10-6mol/LPAMP和10-7mol/LAngⅡ作用72h后，MTT比色A550值分别为：1.4542±0.0039、1.2293±0.0029、1.1333±0.0038、1.0315±0.0033，与对照组(0.9513±0.0046)及10-7mol/LAngⅡ(1.4600±0.0033)相比，随着PAMP浓度的增高，MTT比色A490值均显著降低(P＜0.01)。10-7mol/LAngⅡ组与10-7mol/LAngⅡ+10-9mol/LPAMp组之间差异无显著意义(P＞0.05)，其余各组之间差异均非常显著(P均＜0.01)。表明PAMP可抑制AngⅡ对CFs的增殖作用。 AngⅡ与PAMP共同作用时对胶原合成功能的影响：浓度为10-9、10-8、10-7和10-6mol/LPAMP+10-7mol/LAngⅡ组的3H脯氨酸掺入率分别为1.4542±0.0039、1.2293±0.0029、1.1333±0.0038、1.0315±0.0033dpm。AngⅡ浓度不变的情况下，随着PAMP浓度的增高，CFs的3H脯氨酸掺入率呈递减趋势，各组之间差异有显著意义(P＜0.05)。表明PAMP可抑制AngⅡ促CFs的胶原合成作用。 AngⅡ与PAMP共同作用时对NO合成功能的影响：10-7μmol/LAngⅡ+(10-9、10-8、10-7、10-6μmol/L)PAMP组培养液中NO合成浓度分别为66.15±2.95、80.58±3.77、88.67±1.46、96.22±2.96μmol/L，各组间有显著性差异(P＜0.05)。表明在AngⅡ不变的情况下，随PAMP的浓度增加，合成NO的量显著增多。 五.结论1.AngⅡ能促进CFs增殖和合成胶原，但抑制CFs合成NO。 2.单独应用PAMP不能改变CFs的增殖、胶原合成与NO合成。 3.PAMP能有效抑制AngⅡ促CFs增殖及胶原合成，拮抗AngⅡ抑制CFs合成NO。

目录

文摘

英文文摘

研究背景

材料与方法

1.实验材料

2.实验方法

2.1心肌成纤维细胞的培养、传代及鉴定

2.2实验分组:

2.3测定指标

4.统计学处理

结果

讨论

结论

参考文献

综述 肾上腺髓质素原N端20肽对心血管系统影响的研究进展

英文缩写一览表

在读期间主要工作

致谢

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