罗格列酮对OLETF鼠糖尿病发病的干预及作用机制的研究——罗格列酮对OLETF鼠胰岛β细胞凋亡的影响

摘要

【背景】糖尿病发病率逐年上升，成为继心血管疾病和肿瘤之后的第三大严重危害人类健康的疾病。全球目前有超过1.5亿糖尿病患者，预测到2025年这一数字将会翻一番。近年来，尽管在糖尿病治疗领域取得了不断的进步，但临床上仍然缺乏有效的手段控制糖尿病及其并发症的发生与进展。预防糖尿病的发生，从根本上消除糖尿病带来的危害，成为最受人们关注的问题之一。 在全部糖尿病患者中，90％以上是2型糖尿病患者。几乎所有2型糖尿病都要经过糖耐量异常(impairedglucosetolerance，IGT)阶段。IGT是介于正常和2型糖尿病的过渡阶段。目前认为，IGT患者经过合理的干预治疗，有相当部分患者可使餐后2小时血糖恢复到正常水平，但如果不进行干预治疗，则每年以10％～15％的自然转归率发展为2型糖尿病。目前国内外普遍认为，对IGT人群进行干预，是预防2型糖尿病发生的最有针对性和经费开支最合理的人群。 研究表明，占人类糖尿病患者90％以上的2型糖尿病是可以预防的，且有效的干预可以降低2型糖尿病发病危险31％～58％。 药物干预是目前糖尿病预防的重要手段之一。目前2型糖尿病的干预药物主要包括二甲双胍、α-糖苷酶抑制剂和胰岛素增敏剂。其中TRIPOD和DPP研究显示，胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药物(TZDs)不仅能预防糖尿病的发生，而且与其它干预药物相比，能更有效地降低2型糖尿病的发生率。以TZDs罗格列酮(rosiglitazone)为研究对象之一的大规模前瞻性糖尿病预防研究(DREAM)也已经进行。这表明，TZDs可能是一类非常有前途的糖尿病干预药物。罗格列酮作为TZDs中新开发的一种副作用较小的药物，在2型糖尿病干预中可能发挥更重要的作用。阐明罗格列酮预防糖尿病的机制对更好地利用TZDs尤其是罗格列酮进行糖尿病的防治工作是非常必要的。 2型糖尿病的发病机制尚未完全阐明。目前认为胰岛β细胞功能受损和胰岛素抵抗是2型糖尿病最重要的两个发病因素。胰岛β细胞功能受损作为两个重要的发病环节之一，在近年来受到越来越多的重视，甚至有观点认为胰岛β细胞功能受损相对于胰岛素抵抗在2型糖尿病的发病过程中可能起着更为重要的作用。英国前瞻性糖尿病研究(UKPDS)显示，β细胞功能受损可以导致2型糖尿病患者血糖控制上的恶化。既往研究表明，细胞凋亡是2型糖尿病β细胞数量减少的主要原因，凋亡引起的胰岛β细胞数量的减少足以导致高血糖。 本研究将采用目前国际上公认的优秀自发性2型糖尿病大鼠模型OLETF(OtsukaLong-EvansTokushimaFatty)鼠及其同系非糖尿病对照鼠LETO(Long-EvansTokushimaOtsuka)鼠作为研究对象，用罗格列酮进行干预，观察该药对2型糖尿病的预防作用，并探讨罗格列酮对胰岛β细胞凋亡的作用与可能机制。 研究分以下二部分进行： 第一章罗格列酮对OLETF鼠糖尿病发病的干预作用 【目的】探讨罗格列酮对自发性2型糖尿病大鼠模型OLETF鼠糖尿病发病的干预作用。 【方法】1.以自发性2型糖尿病大鼠模型OLETF鼠和其同系非糖尿病对照鼠LETO鼠为实验对象。大鼠皆为雄性，共分三组。OLETF鼠罗格列酮干预组(干预组)和OLETF鼠对照组(对照组)，每组20只；LETO鼠10只作为正常对照组(LETO组)。从8周龄开始，干预组予罗格列酮溶液灌胃(3mg·kg-1d-1)，其余两组以等量蒸馏水灌胃。 2.定期行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。试验前隔夜禁食15小时、不禁水，按2g/kg予30％葡萄糖溶液灌胃。 3.监测各组大鼠摄食及体重增长情况，每周称量大鼠体重和摄食量一次。 Ⅲ4.实验数据计量资料以均数±标准差(x±s)表示。采用SPSS10.0软件进行统计分析。两样本计量资料比较采用t检验。多组间资料比较用单因素方差分析(ANOVA)检验。糖尿病发病率组间比较用X2检验。检验标准α定为0.05。 【结果】1.干预组和对照组摄食量各周龄均显著高于LETO组(p＜0.01)。干预组摄食量与对照组相比在各周龄均无显著性差异(p＞0.05)。 2.23周龄对照组负荷后2h血糖(2hPG)较前升高(10.1±1.8mmol/L)，显著高于13周龄和18周龄血糖(8.2±0.9，6.7±0.9mmol/L)(p＜0.01)，并随周龄进一步升高(40周龄14.8±3.2mmol/L)。 3.对照组在23周龄出现4例糖耐量异常、1例糖尿病。40周龄时，糖尿病发病率为92.9％；干预组在30周龄有1例糖耐量异常，40周龄时糖尿病发病率为6.7％。干预组的发病率显著低于同时期对照组(p＜0.01)。LETO组无IGT或糖尿病发生。 4.干预组血清甘油三酯、胆固醇、血清游离脂肪酸和血浆胰岛素显著低于对照组(p＜0.05)。 【结论】 1.罗格列酮能够显著降低OLETF鼠血糖升高程度，延缓高血糖的出现； 2.罗格列酮可显著降低OLETF鼠2型糖尿病的发病率，有效预防糖尿病的发生； 3.罗格列酮能够显著降低血清甘油三酯、胆固醇、血清游离脂肪酸和血浆胰岛素水平。 第二章罗格列酮对OLETF鼠胰岛β细胞凋亡的影响 【目的】通过对罗格列酮干预的OLETF鼠及其对照组胰岛β细胞凋亡水平和凋亡相关因素的观察，对罗格列酮抑制胰岛β细胞凋亡的作用和可能机制进行初步探讨。 【方法】1.分别于8、32和40周龄随机处死大鼠。大鼠宰杀后分离胰腺，滤纸吸干水份称重。纵向分离并分置于4％多聚甲醛、液氮和3％戊二醛中待检。 2.以石蜡切片机间隔4μm连续切片。相邻切片分别用标准HE染色观察组织学改变、用免疫组化标记胰岛β细胞、TUNEL+免疫组化法标记凋亡的胰岛β细胞，免疫组化法染色Bcl-2阳性细胞。同时计算凋亡的β细胞百分数。每只鼠至少计数20个胰岛。凋亡的β细胞百分数=(凋亡β细胞数/总β细胞数)×100％。 3.记数Bcl-2阳性细胞数：免疫组化切片中，细胞膜和细胞浆呈棕黄色至深棕黄色者为阳性细胞。肉眼计数阳性细胞数，每只鼠至少计数20个胰岛，并计算阳性率。阳性率=(阳性细胞数/总β细胞数)×100％。 4.电子显微镜观察胰岛β细胞形态。 5.取液氮中的胰腺标本，提取总RNA，以半定量RT-PCR技术扩增凋亡相关基因Bcl-2和Bax，凝胶图像分析系统观察结果，检测各条带辉度，并计算特异条带与内参照GAPDH条带的辉度比值。观察其在基因转录水平上的表达差异。 Ⅴ6.统计学分析实验数据计量资料以均数±标准差(x±s)表示。采用SPSS10.0软件进行统计分析。 【结果】1.各组大鼠胰腺重量随周龄延长有逐渐增加的趋势。但不同周龄大鼠自身比较及相同周龄各组大鼠间胰腺重量均无显著性差异(P＞0.05)。各组8周龄和32周龄胰腺/体重％无显著性差异(p＞0.05)，40周龄LETO组显著高于干预组和对照组(p＜0.01)。 2.8周龄时各组大鼠胰岛结构无明显差别。32周龄，干预组和对照组胰岛与LETO组相比明显肥大，有纤维组织长入。对照组大鼠胰岛纤维化更严重，结构不整齐。40周龄时，对照组大鼠胰岛形状更不规则，纤维组织大量增生，多数胰岛失去正常结构，可见胰岛明显萎缩。干预组大鼠胰岛仍保留基本形态，无明显萎缩。部分胰岛有腺泡侵入或有明显的纤维化。 3.电镜下可见对照组凋亡的胰岛β细胞染色质边集、胞核缩小浓染，出现核固缩。胞质内细胞器萎缩、分泌颗粒数量减少。干预组非凋亡的胰岛β细胞可见细胞器肿胀。 4.LETO组胰岛β细胞凋亡率在8、32、40周龄分别为0.08±0.03％、0.12±0.03％、0.12±0.04％；对照组为0.22±0.02％、0.28±0.03％、0.26±0.03％；干预组32和40周龄为0.18±0.02％、0.17±0.04％。32和40周龄干预组胰岛β细胞凋亡率显著低于对照组(p＜0.01)。 5.LETO组Bcl-2阳性细胞百分率在8、32、40周龄分别为68.45±21.3％、52.76±12.8％、53.01±11.3％；对照组为50.92±9.4％、36.93±1.4％、33.12±7.1％；干预组32周龄和40周龄为59.60±9.9％、55.24±9.7％。 6.各组Bcl-2mRNA表达水平都随周龄增加而降低，但这种变化无显著性差异Ⅵ(p＞0.05)。同周龄各组间的横向比较，在32周龄LETO组表达水平最高，干预组次之，对照组最低，但差异不具有显著性(p＞0.05)。 【结论】1.OLETF鼠胰岛β细胞在糖尿病发生前即有高水平凋亡出现，随病程进展，凋亡水平进一步增高。 2.罗格列酮能显著降低胰岛β细胞凋亡水平，保护胰岛的正常结构和功能，这可能是其延缓、预防糖尿病发生的机制之一。 3.罗格列酮改善胰岛β细胞的糖、脂毒性，减轻胰岛β细胞负担可能是罗格列酮抑制胰岛β细胞凋亡的原因之一。罗格列酮也可能具有对胰岛β细胞凋亡的直接抑制作用。 4.罗格列酮可以通过调节凋亡相关基因Bcl家族成员间的平衡，发挥抗凋亡作用。这种作用可能与其改善糖、脂代谢紊乱有一定关系。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章罗格列酮对OLETF鼠糖尿病发病的干预研究

第二章罗格列酮对OLETF鼠胰岛β细胞凋亡的影响

第1节实验材料

第2节实验方法

第3节结果

第4节讨论

小结

参考文献

附录 英文缩略词表

胰岛β细胞凋亡在2型糖尿病发病机制中的作用

致谢

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