LPS模拟肽疫苗诱导保护性免疫应答的研究

摘要

本课题的主要研究思路是：利用噬菌体肽库筛选获得的短肽模拟LPS的保守性结构表位，将其抗原表位的化学性质由脂多糖改变为短肽，由此使TI抗原改变为TD抗原，进而诱导机体内产生有效的再次抗体应答和交叉保护性免疫。 本课题组在前期的工作中，从噬菌体肽库中筛选了数十个模拟位克隆，选择三个模拟鼠伤寒杆菌LPS表位的序列合成短肽，并证明用这三种模拟短肽免疫动物后，可诱发机体产生针对鼠伤寒杆菌LPS的抗体应答，但由于所获模拟位合成肽的免疫原性较弱，加之当时以BSA为载体，所产生的抗体效价较低，保护作用亦不明显。据此，本研究着重解决了具交叉保护性抗体的纯化，并以此多克隆抗体为筛选靶分子筛选到了两个系列的环七肽序列；从中选择了一个序列，经修饰设计后进行短肽合成；并以此合成肽13L与前期所获序列分别交联新型载体——蓝载体(BC)作为实验性疫苗，通过体内外实验鉴定其抗原性、免疫原性及诱导再次抗体应答产生的规律；同时，也观察了该疫苗诱导小鼠的对细菌攻击及内毒素休克的保护作用。本研究包括以下三个部分： 一、LPS交叉保护性模拟位展示肽克隆的筛选 1、制备具交叉反应性的纯化抗LPS多克隆抗体作为筛选靶分子制备大肠杆菌LPS2630亲和层析柱，自前期研究中制备的具交叉保护性抗鼠伤寒沙门氏菌抗血清中纯化出抗LPS2630多克隆抗体，经试验证实该抗体可与不同种属的LPS结合，提示不同种属LPS之间存在共同表位或交叉表位，而我们所纯化的多克隆抗体为交叉反应性抗体。 2、从噬菌体环七肽库中筛选到可模拟LPS表位的保守序列以纯化的抗大肠杆菌LPS2630多克隆抗体为筛选肽库的靶分子，对噬菌体随机环七肽库进行了三轮筛选后，鉴定出12个阳性克隆，均可与包被及游离纯化多克隆抗体产生较强的结合，经DNA测序获得了以上12个克隆短肽序列为：c-X-XDXX-X-c、c-X-DXXX-XX-c、c-ASKCTKA-c、c-NNITRHC-c、c-PKQPFAH-c、c-VSPNQTI-c。 3、所获序列以亲水性氨基酸为主，提示模拟LPS亲水表位对12个阳性噬菌体克隆展示肽的序列分析发现，我们筛选获得的短肽序列中亲水性氨基酸含量的平均值为68％，而前期工作中用抗鼠伤寒沙门氏菌多克隆抗体筛选获得的模拟短肽序列中亲水性氨基酸含量的平均值为20％，提示我们筛选获得的短肽可能模拟LPS的亲水性抗原表位。 二、模拟肽疫苗的制备及抗原性与免疫原性鉴定在前期工作获得多个噬菌体LPS表位模拟肽序列的基础上，本研究进行了重新设计并合成了四种LPS表位模拟肽13a、13b、12w及13L，合成时在原短肽序列两侧各加入两个氨基酸以稳定环七肽构象。由于短肽分子量过低而不具备免疫原性，遂将其与BSA交联作为体外抗体检测的抗原，与蓝载体(BC)交联作为免疫原免疫小鼠与家兔，观察模拟肽与不同抗LPS的结合，及体内诱导抗体产生的规律。 三、模拟肽疫苗诱导的保护性免疫反应 1、四种合成肽-BC均可诱导小鼠产生对LD90致死量鼠伤寒菌攻击的保护在免疫四次及给予灭活鼠伤寒沙门氏菌攻击后第8天，以LD90致死量鼠伤寒沙门氏菌自小鼠腹腔内注射0.2mL/只攻击免疫小鼠，观察攻击后小鼠存活情况。PBS/BC免疫对照组小鼠在细菌攻击后6天内死亡，而各合成肽-BC交联物免疫组小鼠存活时间均较对照组有所延长，在单个肽免疫组中，合成肽13L-BC免疫组小鼠存活时间最长，平均存活时间为12天，最高存活时间达到15天；而四种合成肽组合免疫组小鼠存活时间与单个肽免疫组小鼠存活时间相比均有明显延长，其中以包含13L-BC交联物混合免疫组的小鼠存活时间延长最为明显，平均存活时间均在11天以上；四种合成肽共同混合免疫组小鼠13abwL存活时间平均为14天，且组内有两只小鼠在细菌攻击后未死亡(3个月后处死时仍保持高水平抗体滴度)。提示合成肽-BC免疫后小鼠体内产生的抗LPS抗体对遭受细菌攻击的免疫动物具不同程度的保护性作用。 2、模拟肽疫苗可诱导产生对内毒素休克的预防作用本部分研究中我们建立了直接注射LPS致小鼠内毒素休克的模型，对免疫后经检测确定小鼠体内抗体效价在1：1600以上的小鼠，经尾静脉注射200μg大肠杆菌LPS2630，经颈总动脉插管检测小鼠血压变化。 实验结果显示，免疫组小鼠体内抗体能有效阻断LPS的作用，防止中毒性休克的发生。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章LPS交叉保护性模拟位展示肽克隆的筛选

1.1材料与方法

1.1.1主要试剂

1.1.2主要溶液配制

1.1.3主要仪器与器材

1.1.4抗LPS2630交叉保护性多克隆抗体的纯化及鉴定

1.1.5以抗LPS多克隆抗体为靶对噬菌体环七肽库的筛选

1.1.6噬菌体克隆鉴定

1.2结果

1.2.1兔抗鼠伤寒沙门氏菌血清及纯化抗LPS 2630多克隆抗体与LPS的结合反应

1.2.2噬菌体环七肽库的筛选

1.2.3噬菌体克隆与包被的抗LPS 2630多克隆抗体的结合

1.2.4抗L2630纯化多克隆抗体对噬菌体结合的抑制试验

1.2.5 S.Typhi LPS 7261对噬菌体克隆与抗S.Typhi LPS多克隆抗体结合的抑制

1.2.6阳性噬菌体克隆与多种属LPS多克隆抗体的结合

1.2.7 DNA测序及氨基酸序列分析

1.3讨论

1.4 小结

第二章合成模拟肽疫苗的制备及抗原性与免疫原性鉴定

2.1材料与方法

2.1.1主要试剂和溶液

2.1.2合成模拟肽的抗原性鉴定

2.1.3合成肽的免疫原性鉴定

2.2结果

2.2.1合成模拟肽的抗原性鉴定

2.2.2合成模拟肽的免疫原性鉴定

2.3讨论

2.4 小结

第三章模拟肽疫苗诱导的保护性免疫反应

3.1材料与方法

3.1.1主要材料

3.1.2实验方法

3.2结果

3.2.1鼠伤寒沙门氏菌攻击小鼠模型的建立

3.2.2合成模拟肽免疫小鼠诱导的对鼠沙门氏菌攻击的保护

3.2.4合成模拟肽免疫小鼠诱导对内毒素性休克的保护

3.3讨论

3.4小结

全文总结

参考文献

英文缩略词表

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